溶血磷脂酸上调thp1细胞基质金属蛋白酶9的

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1、溶血磷脂酸上调THP1细胞基质金属蛋白酶9的【摘要】　　目的探讨基质金属蛋白酶9(MMP9)在溶血磷脂酶(LPA)致动脉粥样硬化中的作用及机制。方法以不同浓度LPA(0～10μmol/L）刺激人单核细胞株THP1细胞4h，RTPCR法测定MMP9mRNA表达，酶谱法检测MMP9活性，MP9表达及活性，核蛋白NFκBp65表达逐渐增强，在LPA1μmol/L时达到最高点，然后逐渐减弱，LPA以剂量依赖的方式激活NFκB，在转录水平促进THP1细胞MMP9mRNA表达，增强MMP9活性。结论LPA可能通过激活NFκB，在转录水平促进THP1细胞MMP9mRN

2、A表达，并增强其活性，促进粥样硬化发生和发展。【关键词】溶血磷脂酸；THP1细胞；基质金属蛋白酶9　　溶血磷脂酸（LPA)是一种结构简单，具有激素和生长因子样的磷脂信使。近年来研究发现，LPA具有促进动脉硬化和血栓形成的作用，因此引起极大重视〔1〕。从血小板活化、内皮细胞功能障碍、诱导与维持血管壁炎症反应，到增加斑块的不稳定性、导致斑块破裂、局部栓子形成，进而导致脑卒中或心肌梗死等缺血事件的发生等无不与LPA密切相关。MMP9，又称明胶酶B，是MMP家族中的一个重要成员，对血管壁的基底膜和细胞外成分具有清除作用，使纤维帽崩溃影响斑块的稳定性。MMP9不仅能促进动脉粥样硬化(AS

3、)的发展〔2〕，并且是AS斑块不稳定的主要因素〔3〕。单核巨噬细胞是参与粥样硬化的主要炎性细胞。有研究表明，LPA能活化单核细胞和T淋巴细胞，促进其表达和分泌MMPs，而后者的表达和活化是LPA导致斑块不稳定或破裂的主要因素之一〔4〕。本研究应用LPA刺激体外培养的人单核细胞株(THP1)，观察LPA对MMP9表达及活性变化以及核因子NFκB表达变化，进一步探讨LPA在致动脉粥样硬化中的作用及机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　TrizolReagent为Invitrogen产品；TaqDNA聚合酶及缓冲系统、dNTPMix为Fermentas产品，DNAMarker和RNa

4、sin购自TaKaRa，ReverTraAceαTMFirstStrandcDNASyntheslsKIT为TOYOBO产品，THP1为人单核细胞株，购自BIOCHAIN公司，18∶1LPA购自SigmaAldrich公司，MMP酶谱分析试剂盒（MMP2、MMP9)购自普利莱基因技术有限公司，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)。　　1.2细胞培养及干预试验　　THP1细胞培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，5％CO2下生长。THP1为悬浮型生长，2～3d换液，细胞生长至(4～6)×106／ml时及时传代。将THP1细胞无血清培养过夜，以1

5、06/孔接种于24孔培养板，分别以LPA0、0.1、0.5、1、5、10μmol/L处理4h后收集细胞，以RTPCR法检测MMP9mRNA水平。酶谱法检测MMP9活性。提取细胞核蛋白以MP9引物及内参GAPDH引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下：MMP9上游：5′TCCCTGGAGACCTGAGAAC3′，下游：3′TTGATGAGCCTTCTGAACGG5′，扩增片断长度为306bp；GAPDH上游：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增片段长度450bp。取PCR产物各5μl在1.

6、0％琼脂糖凝胶中电泳(120V恒压电泳45min)，应用GelDoc2000型全自动凝胶成像分析仪(BoiRad公司，美国)照相并测定每条带的光密度值，以GAPDH表达量为内对照计算并比较各组样本MMP9的相对表达量。　　1.4MMP9活性检测　　采用酶谱法检测。按照蛋白抽提试剂盒操作说明抽提细胞总蛋白。取5μl阳性混合物与试剂1(2XSDSPAGEnonreducingbuffer，普利莱基因技术有限公司，P1700)混合等体积混合，待测样品5μl按照1∶1稀释与试剂l混合后直接上样每孔10μl，不加热变性，以30mA恒流电泳，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。小心去除压缩胶

7、层，放入干净瓶皿中以适量蒸馏水冲洗凝胶。以加入试剂4(10ml1×bufferA)，室温漂洗凝胶2×15min。中间换液23次。倒掉BufferA，加入试剂5(10ml1×bufferB)，室温孵育4h。凝胶加入SDSPAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液。于扫描仪上扫描凝胶，显示调整为灰度，并分析IOD值。92kD为MMP9，130kD、225kD为proMMP9）。以对照组(LPA0μmol/L)条带的光密度为1。同一条带上其余的与之