高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌核呼吸因子1表达的影响

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1、高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌核呼吸因子1表达的影响：马慧娟刘敬珍宋光耀高宇王超【摘要】目的观察高脂饮食和罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌核呼吸因子1（NRF1）表达及葡萄糖输注率的影响。方法21～23月龄ethodsMalealefn2inskeletalmuscleinedbypolymerasechainreactionandRNAandproteinlevelsofNRF1uscle.Insulinsensitivityisimprovedentbyincreasingexpressio

2、nofNRF1inskeletalmuscle.【Keyg·kg-1·d-1外,其余各组喂养条件同前,继续喂养4g·kg-1·d-1灌胃，对照组和高脂组给予等量蒸馏水灌胃，1次/d，共4g/kg麻醉,右侧颈动脉和颈静脉插管，管腔内注入肝素抗凝，末端由实芯不锈钢针封闭，由皮下延伸到颈后并固定。经4～5d的术后恢复,使动物在清醒、自由活动下进行钳夹试验。术中胰岛素输注速度为4mU·kg-1·min-1,葡萄糖浓度为30%。　　1.2.3血液和骨骼肌指标检测　　血清血糖和三酰甘油采用酶法，骨骼肌三酰甘油经氯

3、仿/甲醇抽提后采用BeckmanLx20全自动生化分析仪测定。血清游离脂肪酸采用铜显色法测定；血清胰岛素采用放射免疫法测定。　　1.2.4骨骼肌NRF1mRNA的表达　　采用Trizol一步法提取骨骼肌组织的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。各组取2μg总RNA进行逆转录反应，然后分别以大鼠βactin和NRF1的特异性引物进行PCR反应。所用引物序列如下：NRF1上游5＇TCTCACCCTCCAAACCCAAC３＇，下游5＇CGCACCACAT

4、TCTCCAAAGG３＇。反应参数为：96℃预变性4min，然后95℃30s、58℃30s、72℃30s反应30个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行光密度分析。以βactin作为内参照，计算NRF1mRNA表达的相对量。　　1.2.5骨骼肌NRF1蛋白表达　　100mg骨骼肌组织加入1ml组织裂解液〔1%NP40，150mmol/LNaCl，50mmol/LTrisHCl，pH7.5，10%甘油，1mmol/LNa3VO4(钒

5、酸钠)，1mmol/LPMSF，1mmol/LDTT〕中匀浆，冰浴30min，使细胞充分裂解。4℃，8000r／min离心10min，收集上清液，考马斯亮蓝法测定各样品的蛋白含量。各组样品分别取50μg蛋白加入5×SDS上样缓冲液（0.1mmol/LTrisHCl，pH6.8，2%甘油，0.1%溴酚蓝，10%β巯基乙醇，4%SDS）混合均匀，100℃沸水浴5min使蛋白变性。冷却后以10%SDSPAGE电泳分离，然后电转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入400倍稀释的甘油醛3磷

6、酸脱氢酶（GAPDH）、NRF1的特异性抗体（购自SantaCruz公司），4℃孵育过夜。PVDF膜漂洗后加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥），孵育1h，DAB显色。目的条带以凝胶成像分析系统进行光密度分析，GAPDH为内参照。　　1.3统计学分析　　所有数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，组间差异显著时进行两两比较。　　2结果　　2.1一般项目比较　　各组实验室检验结果见表1。表1各组大鼠第8周末一般资料的比较(略)　　2.2正常葡

7、萄糖高胰岛素钳夹实验　　喂养第4周时进行钳夹实验，与青年对照组比较,老年对照组葡萄糖输注率下降(P<0.05),高脂组下降更明显(P<0.01),表明两组大鼠IR模型成功，高脂组与干预组差异无统计学意义。喂养第8周,老年对照组与青年对照组及高脂组比较,葡萄糖输注率改变更明显(P<0.01),罗格列酮干预后,其葡萄糖输注率较高脂组明显升高(P<0.01),见表2。表2各组大鼠葡萄糖输注率的比较(略)　　2.3各组大鼠骨骼肌NRF1的mRNA和蛋白的表达　　与青年对照组(2.98±

8、0.31)比较，老年对照组骨骼肌NRF1mRNA表达下降(2.12±0.24)，高脂组(0.94±0.09)进一步下降，差异有统计学意义(P<0.01)；罗格列酮干预组NRF1mRNA表达(1.51±0.98)较高脂组升高，但仍低于老年对照组，组间差异有统计学意义(P<0.01)。同样，与青年对照组比较，老年对照组骨骼肌NRF1蛋白表达下降，高脂组进一步下降(均P＜0.01)，罗格列酮干预组NRF1蛋白表达较高脂组高，但