罗格列酮上调高脂饮食老年大鼠骨骼肌glut4和pkb的表达的论文

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1、罗格列酮上调高脂饮食老年大鼠骨骼肌GLUT4和PKB的表达的论文罗格列酮上调高脂饮食老年大鼠骨骼肌glut4和pkb的表达【关键词】老年;胰岛素抵抗;葡萄糖转运蛋白4;蛋白激酶b;罗格列酮【摘要】目的观察高脂饮食对老年大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(glut4)和蛋白激酶b(pkb)的表达变化及罗格列酮的干预效果。方法老年大鼠随机分为对照组、高脂组(hf)、高脂+罗格列酮干预组(rsg),每组20只。应用清醒状态下正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术的葡萄糖输注率评价胰岛素抵抗，用荧光定量pcr法和ethodsaleatetablets(rsg)groups,20ratsineachgr

2、oup.insulinsensitivityiceuglycemicclamptechniques,theexpressionsofglut4mrnaandpkbmrnaandproteinepcrandusclelongchainfattyacylcoenzymea(lcacoa)ent,itmaybetheoneofthemechanismofimprovinginsulinresistance.　　【keyan软件设计(上海生物工程公司合成)：glut4引物上游序列：5′cccacaaggcaccctcacta3′，下游序列：5′tgccacccacagag

3、aagatg3′，扩增片段长度62bp。pkb引物上游序列：5′tctacggtgcggagattgtg3′，下游序列：5′cccggtacaccacgttcttc3′，扩增片段长度66bp。g/kg灌胃，对照组喂养条件同前，继续喂养4g肌肉组织在10%三氯乙酸中匀浆，10000r/min离心10min，弃上清，分别用1ml的乙醚和水充分洗涤沉淀物2次，每次离心10min。加入250μl的10mmol/l二硫苏糖醇，涡旋后加入1mol/lkoh调整ph升至11.5，55℃孵育10min。加入500mmol/lkh2po4缓冲样品，用1mol/lhcl调整ph至7.

4、0，13000r/min离心10min，弃上清。取250μl下层液体加入750μl缓冲液，混匀(缓冲液成分组成：2ml500mmol/lph7.0kh2po4，26μl100mmol/lα酮戊二酸，6～7mgnad+，18mlh2o，37℃孵育)。在每个试管中加入7μlα酮戊二酸脱氢酶，用移液管吸打混匀，在10min和20min分别在荧光分光光度计(激发波长360nm，发射波长460nm)读取读数，确保反应完全。测出荧光值后，在标准曲线上计算lcacoa的浓度，以nmol/g组织表示。　　1.3.4骨骼肌glut4mrna及pkbmrna检测　　常规方法提取骨骼肌rna

5、和反转录。实时定量pcr体系(50μl)：实时荧光定量试剂(5×sybr绿染)10μl，2u/μltaq酶1.5μl，25mmol/ldntp0.5μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，cdna模板5μl，双蒸水31μl。反应条件：93℃预反应3min;93℃1min，55℃1min，72℃1min，40个循环，于每个循环延伸反应最后时刻收集荧光信号。　　1.3.5l裂解液〔100mmol/ltrishcl,ph8.0,1mmol/l乙二醇乙二醚二胺四乙酸(egta),1mmol/l乙二胺四乙酸(edta)，1mmol/l苯甲基磺酰氯(pmsf)，1mg/l亮抑酶

6、肽,1mg/l抑肽酶,50mg/l胰蛋白酶〕加入150mg组织，匀浆后分离上清，用考马斯亮蓝试剂盒进行蛋白定量。取50μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sdspage)电泳，10%分离胶，湿法电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h后，分别加入glut4和pkb多克隆抗体，4℃过夜，充分洗膜后加入hrp标记的二抗室温孵育2h，二氢基联苯胺(dab)显色。重复上述步骤进行内参照gapdh(一抗1∶5000稀释，二抗1∶3000稀释)的结合。目的蛋白表达量以其特异性结合条带与gapdh结合条带的光密度比值表示。　　1.4统计学分析　　用spss11.5软件进

7、行统计分析，数据用x±s表示，组间差异用单因素方差分析(onerna和蛋白表达明显降低(p<0.05或p<0.01)，hf+rsg组glut4、pkbmrna和蛋白表达与hf组相比明显升高，差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。见表2，图1，图2。图1各组骨骼肌glut4、pkbmrna的表达表2各组大鼠骨骼肌glut4，pkbmrna和蛋白表达水平　　2.3高胰岛素　　正葡萄糖钳夹实验结果第4周，hf组和hf+rsg组葡萄糖输注率〔(18.83±2.18)，(18.45±1.