反义寡核苷酸和丙戊酸对心肌细胞肥大组蛋白脱乙酰基

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1、反义寡核苷酸和丙戊酸对心肌细胞肥大组蛋白脱乙酰基【摘要】　　目的观察反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸对大鼠心肌细胞肥大组蛋白脱乙酰基酶2（histonedeacetylase2，HDAC2）表达的影响。方法常规方法培养原代心肌细胞，利用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激心肌细胞制造心肌细胞肥大模型，应用HDAC2反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸进行干预。给予AngⅡ12h和24h后进行逆转录聚合酶链反应（RTPCR）观察HDAC2mRNA表达；通过相差显微镜观察心肌细胞的面积；利用免疫组织化学法检测心肌细胞HDAC2蛋白的表达。结果与正常对照组相比，肥大组心肌细胞面积增加，HDAC

2、2mRNA和蛋白表达均增加。与肥大组相比，HDAC2反义脱氧寡核苷酸组和丙戊酸组的心肌细胞面积均减小（P＜0.05，P＜0.05），HDAC2mRNA和蛋白表达亦减少（P＜0.05，P＜0.05），但仍高于正常对照组（P＜0.05，P＜0.05）。结论体外AngⅡ致心肌细胞肥大过程中伴有HDAC2的mRNA和蛋白表达增加，应用HDAC2反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸后可使之下降，表明HDAC2在心肌细胞肥大中发挥着促进作用。【关键词】组蛋白脱乙酰基酶2；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；肥大；反义脱氧寡核苷酸　　心肌细胞肥大是一种复杂的、多种因素参与调节的动态过程，包括血管紧张

3、素Ⅱ（AngⅡ）在内的多种化学因素、多种机械刺激的作用都有可能导致心肌细胞的肥大。尽管对于其中的内在机制尚未完全明确，目前认为在心脏肥大的细胞信号传导通路中，组蛋白脱乙酰基酶（histonedeacetylases，HDACs）可能是一个重要的终极靶点〔1〕。HDACs分为三类，其中Ⅰ类HDACs被推断认为有可能对于心肌肥厚发挥着促进作用，但目前有待于进一步明确〔2〕。本课题组以Ⅰ类HDACs之一——组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2）为着眼点，以AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大，给予HDAC2反义脱氧寡核苷酸和HDACs抑制剂——丙戊酸进行干预。通过观察HDAC2在这

4、一过程中的变化，以求证其对心肌细胞肥大的促进作用；同时也可证明丙戊酸作为临床上常用的一种抗癫痫药物，对于心肌肥厚有一定的抑制作用。　　1材料与方法　　1.1材料　　新生1～3dEM，美国Hyclone公司。兔多克隆抗体人HDAC2（H54）及羊抗兔抗体，美国SantaCruz公司产品。丙戊酸钠，美国Sigma公司。二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂，TakaRa公司。相差光学显微镜，Nikoneclipsets100。紫外透射检测分析仪FS312，上海复生生物工程研究所。RTPCR引物和HD

5、AC2错义脱氧核苷酸序列由北京奥科公司合成。FuGENE6，瑞士Roche公司。　　1.2FuGENE6转染反义脱氧寡核苷酸　　按照FuGENE6说明书进行操作。于无菌试管中预先放入97μl无血清培养液，加入FuGENE63μl，室温下孵育5min。加入HDAC2反义脱氧寡核苷酸2μg形成混合物，混匀后均于室温下孵育30min。反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN)序列为5′GATGGGAAGGAGAGCAGCACAG3′。　　1.3心肌细胞培养　　取新生2～3dEM培养液的平皿中。去除心房心包膜及附属大血管后，0.25%胰酶反复消化、取上清，将收集的上清液用20

6、00r/min离心10min。弃上清，在离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，将细胞重悬，细胞计数。按细胞数2×105/ml接种于6孔板培养。细胞分为正常对照组、肥大组、反义组和丙戊酸组。肥大组、反义组和丙戊酸组均加入10-5mol/LAngⅡ，AngⅡ终浓度为2×10-7mol/L；反义组加入于上述HDAC2反义脱氧寡核苷酸混合物；丙戊酸组加入丙戊酸，其终浓度为10-3mol/L；正常对照组仅加入等量无血清培养液。加入AngⅡ后12h和24h进行以下检测。　　1.4相差显微镜下观察细胞面积变化　　各组均随机选取10个视野，每个视野随机选取10个心肌

7、细胞，在1600倍下应用MoticImages1.3软件测量心肌细胞面积，计算平均值。　　1.5RTPCR检测HDAC2mRNA表达　　以Trizol(Invitrogen公司产品)提取心肌细胞中的总RNA,用紫外分光光度计测总RNA纯度和含量，按照TaKaRaRTPCR试剂盒说明书进行操作。HDAC2基因引物序列：上游：5′GCTCGATGTTGGACGTATGAGAC3′；下游：5′ACCTCCTTCACCTTCATCCTCAG3′；扩增片段长度为364bp。βactin基因引物序列：上游：5′TTGTAACCAACTGGGACGATATGG

8、3′；下游：5′GA