二十碳五烯酸对人肝癌hepg2凋亡细胞线粒体的影

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1、二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影【关键词】二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体　　EffectsofeicosapentaenoicacidonapoptosisandmitochondriainHepG2cells【Abstract】AIM:ToinvestigatethemitochondriachangesinhumanhepatoblastomaG2（HepG2）cellapoptosisinducedbyeicosapentaenoicacid(EPA).METHODS:IntheHepG2cellsincubatedi

2、tochondriafunctionandquantityinedethylthiazolyltetrazolium（MTT）colorimetricassayandfluorescenceprobe.TheexpressionandactivityofCaspase9easuredinHepG2cellapoptosisol/LEPA，HepG2cellsdisplayedtheapoptosisbytheDNAladderpattern;thenumberofthemitochondriaitochondriaitochondriamayplayagr

3、eatroleintheHepG2cellapoptosisinducedbyEPA.【Keyitochondria【摘要】目的：探讨二十碳五烯酸（EPA）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对线粒体的影响.方法：HepG2细胞与经EPA处理后，DNALadder检测细胞凋亡的发生，应用线粒体荧光探针和四唑盐（MTT）比色法分析细胞线粒体数量和功能，应用免疫印迹法和特异性底物检测HepG2细胞Caspase9蛋白酶的表达和活性.结果：终浓度为120μmol/LEPA处理HepG2细胞24h后，可以检测到凋亡标志性的DNA梯形带；细胞线粒体数量减少，MTT比色法

4、检测A值为0.173±0.065（P<0.01），提示线粒体功能降低；线粒体相关凋亡级联反应的启动分子Caspase9蛋白表达增加，Caspase9酶活性增强至75.4±4.8，与未经EPA处理HepG2细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）.结论：EPA可能通过损伤线粒体诱导人肝癌HepG2细胞凋亡.【关键词】二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid,EPA）属于n3多不饱和脂肪酸（n3polyunsaturatedfattyacid，n3PUFA），主要存在于深海鱼油中，是一类对

5、人体有益的重要营养素.近来的研究表明n3PUFA可以抑制肿瘤细胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中诱导肿瘤细胞凋亡可能是主要机制之一［2］.有研究发现，EPA可以通过p53依赖，Fas介导途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡［3］.我们采用DNA梯形带检测,MTT比色法和激光扫描共聚焦显微镜检测等方法，通过观察EPA对体外培养的HepG2细胞凋亡和线粒体的影响，初步探讨线粒体损伤在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中所发挥的作用，为进一步研究n3PUFA在抗肿瘤方面的功效提供一定的理论基础.1材料和方法1.1材料人肝癌HepG2细胞购自中国科学院上海生化与细胞

6、所；DMEM培养基购自美国Gibco公司；EPA，四唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；线粒体荧光探针MitoTrackerRed购自美国MolecularProbe公司；小鼠抗人Caspase9mAb为美国NeoMarker公司产品；Caspase9蛋白酶特异性底物AcLEHDAMC为美国Alexis公司产品.1.2方法1.2.1细胞培养与分组HepG2细胞常规培养于含有10mL/L小牛血清的DMEM培养液.试验分为：处理组HepG2细胞于对数生长期应用EPA（终浓度为120μmol/L培养液）处理24h后收获；对照组采用正常培养未经EPA处理的Hep

7、G2细胞.1.2.2DNA梯形带法检测细胞凋亡细胞经处理后收获约1×106个细胞，PBS洗涤细胞2次，加150μLNP40裂解液裂解细胞5h，离心收集上清，150μLNP40细胞裂解液重复抽提沉淀1次，将上清置于等体积10g/LSDS溶液中并混匀，加入RNaseA（终浓度为2μg/mL），56℃孵育2h，加蛋白酶K至终浓度为2μg/mL，37℃水浴2h，加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃过夜，4℃高速离心30s，弃上清，750mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20μLTE缓冲液溶解DNA，取5μLDNA进行20g/L琼脂糖凝胶电泳

8、.1.2.3激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体HepG2细胞制成细胞爬