蔗糖酶同工酶谱带鉴定

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1、一、实验目的和要求1.学习SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的基本原理和操作方法。2.蔗糖酶分离纯化产物的SDS-PAGE检测分析。二、实验内容和原理含ci-醇酮基的糖具有还原性.在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲臜(formazan),后者在可见光区有最大吸收。该反应在一定条件下可定量完成，且生成的有色甲臜具有一定的稳定性。三、实验材料和试剂1.实验材料：蔗糖酶样品(样品I、II、III、IV)。2.实验试剂：(1)30.8%凝胶贮液:丙烯酰胺(Acr)30g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml,过滤。贮于

2、棕色瓶，可在4°C保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。(2)分离胶缓冲液:3mol/LTris-HClpH8.9。(3)浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HClpH6.7。(4)10%SDSo(5)TEMED(N,N,N',N'—四甲基乙二胺)(增速剂)。(6)10%过硫酸铵(引发剂)。(7)0.l%TritonX-100溶液。(8)含5%蔗糖的0.2mol/L乙酸缓冲液(pH4.6)。(9)0.1mol/L碘乙酰胺。(10)现配的含0.2%(w/v)2,3,5-triphenyltetrazoliumchlo

3、ridemonohydrate(TTC)的lmol/LNaOH溶液。(11)7.5%乙酸。(12)5X蛋白质上样缓冲液。四、实验器材与仪器1.电泳仪、垂直电泳槽及配件(长短玻璃板各1块、封胶条2条、梳子1个)。2.微量移液器：10Pl、200Pl、1000Pl。1.烧杯、长滴管。2.恒温水浴50°C、100'Co3.高速台式离心机。4.离心管(1.5ml、0.5ml)及离心管架。5.<215cm培养皿(染色、脱色用)。五、操作方法和实验步骤1.准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。2.配胶及凝胶的制备：(1)配制凝胶：SDS-不连续体系聚丙烯酰胺凝胶配制8%分离

4、胶所雷试剂量(ml)4%求缩胶所需试剂量(ml)30.S。/。凝肢贮液20.353moi/LTris-HClpH8.9分离胶缓冲液0.95O.SmoVLTris-HClpH6.7浓缩胶缓冲液0.32TEMED0.0030.00310%SDS0.0750.025蒸馏水4.51.810%Ap0.0400.020总体积(ml)7.52.5注：1.为去除抑制胶聚合的氧，加入AP前可进行抽气处理；2.过硫酸铵和TEMm)的量应根据室温或聚合情况而定。(2)凝胶板的制备：①分离胶的制备：按上表配制7.5ml分离胶，混合均匀后将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，再用少

5、许蒸馏水(或水饱和的异丙醇或正丁醇)沿长玻璃板侧壁缓慢注入，约5mm高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水。②浓缩胶的制备：按上表配制2.5ml浓缩胶，混匀后将浓缩液加到己聚合的分离胶上方，直至离短玻璃板上得约0.Ion处，轻轻将样品槽模板(梳子)插入浓缩胶内，约lOmin后凝胶聚合。小心拔去样品槽的槽板(梳子)，将电泳缓冲液倒入上、下贮槽屮，电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。1.样品处理与加样：(1)样品制备：取蔗糖酶样品(样品I、II、III

6、、IV)各50ul,分别放入1.5ml离心管中，12000r/min离心15min,收集上清为样品溶液。(2)样品处理：将样品溶液分别按体积加入“5X蛋白质上样缓冲液”和10%SDS,比例为样品：10%SDS:5X蛋白质上样缓冲液=3.5:0.5:1。(3)加样：用微量注射器向样品槽内注入2〜5ul样品混合液。如样品浓度较低，可适当增加上样量。样品Iniv-iIV-2IV-3IV-4IV-5上样量(gl)222555552.电泳：在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽(加样孔端)接负极、下槽接正极，接电泳仪电源,电流按制在2〜3mA/样品孔，一般样品进浓缩胶前，

7、电流控制在10〜20mA,待样品进分离胶后，将电流调到20〜30mA，保持电流强度不变(恒流)，待指示染料迁移至卜沿约0.5〜lcm处停止电泳。3.剝胶：电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开短玻璃板，将凝胶一角切下做一加样标记，将凝胶板放在C15cm培养皿内，凝胶用去离子水漂洗2次，每次3分钟。4.染色：(1)凝胶浸入0.l%TritonX-100溶液中，静置20min，然后用去离子水漂洗两次，每次5分钟。(2)凝胶放入含5%蔗糖的0.2nx)l/L乙酸缓冲液(pH4.6)中，50°C保温30min。(1)凝胶用去离子水5分钟，然后加入0.lmol/L

8、碘乙酰胺，室温放置5分钟。(1)凝胶浸入现配的含0.2%(w/v)2,3,5-t