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1、超声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送 血脑屏障（bloodbrainbarrier,BBB）对脑组织产生屏蔽作用，减少或消除血液中有害物质（如毒素、病毒）对脑组织可能产生的损害，但同时阻碍了药物进入脑组织，给脑部疾病治疗带来障碍[1].如何通过药物载体或药物递送技术将药物有效穿透BBB到达靶区，成为药剂学研究和脑部疾病药物治疗的关注重点。最近，无创和有限开放BBB的研究受到关注，如低频聚焦超声联合微泡造影剂可开放BBB[2,3],并且超声微泡已得到临床应用，其安全性和有效性已被证实，如已上市的微泡产品Defin
2、ity、Optison、Imagent和全氟显。 超声破碎微泡可产生空化效应。虽有研究证明低频聚焦超声联合微泡可开放BBB,但要做到高水平、无创可逆、靶向开放BBB,必须在大量实验基础上针对具体微泡和超声条件，探讨最适宜实验参数，包括超声频率、功率、辐照时长和微泡剂量。低频（1MHz）超声可有效发挥微泡的空化效应[4,5],不仅能将大量微泡推送至对侧管壁，而且很少对微泡产生聚集作用[6,7]. 本文通过固定超声频率、功率和微泡浓度剂量，改变辐照时长，确定无创可逆开放脑胶质瘤部位BBB的理想实验参数，并证明超
3、声微泡可用于脑胶质瘤靶向药物递送。 材料与方法材料脂质微泡按照文献[8]处方和工艺，在超声实验前制备。取大豆磷脂、吐温80、聚乙二醇1500（4∶10∶100,L,轻摇形成微泡混悬液。微泡大小均一，平均粒径约3.26μm,生理盐水稀释后的浓度为5.8108~6.7108/mL,大鼠给药剂量为3mLkg?1.伊文思蓝（Evansblue,EB,Sigma公司）；4%多聚甲醛（重庆市北碚化学试剂厂）。大鼠C6胶质瘤细胞株购于中国科学院上海细胞库。荷瘤雄性SD（Sprague-Dapus公司）；ACASULT
4、MA312型激光共聚焦显微镜（美国Meridian公司）。 脑胶质瘤模型的建立调整C6细胞数为1106/10μL,用台盼蓝排斥实验检测细胞活力>95%.腹腔注射1%戊巴比妥钠（3mLkg?1）麻醉大鼠，剪去头顶部毛，在内毗连线与头部矢状中线交汇处，纵向头皮切口约1cm长分离，暴露颅骨。将头部固定在大鼠脑立体定位仪上，用碘酒、酒精顺序消毒，铺洞巾。 选取大鼠右侧脑尾状核区为靶点，根据大鼠头部立体定向解剖图，确定对应于右脑尾状核的钻孔位置。 用牙科钻钻直径约1mm孔，深达硬脑膜表面但不刺破硬脑膜。
5、用微量注射器吸取10μL细胞悬液，调节定位仪上的针尖使其触及硬脑膜，进针6mm,后退1mm,使针尖距硬脑膜为5mm,将细胞缓慢注入脑内，注射速度约为2.5μLmin?1,注完后留针约5min,缓慢退针，用无菌骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，切口消毒。手术在无菌环境下操作。对照组大鼠以等体积的培养液替换细胞悬液。 BBB开放性检测EB靶点染色EB静脉注射后可立即与血浆白蛋白结合，形成EB白蛋白复合物。复合物分子量大，不能透过完整BBB;但BBB开放时复合物可渗透通过BBB,并且渗出量和BBB开放程度呈正相关
6、。因此可根据脑实质EB染色程度推测BBB开放程度。 大鼠超声辐照后立即尾静脉注射0.2%EB溶液，剂量为2mLkg?1,4h后打开左侧胸腔，生理盐水灌注，至右心房流出灌注液变澄清，再用磷酸盐缓冲液（pH7.4）灌注至动物出现肌肉抽搐后，再缓慢灌注30min,然后处死大鼠，断头，取端脑，用4%多聚甲醛溶液固定脑组织，72h后切片。 荧光显微镜观察脑组织冰冻切片，在显微镜下观察超声辐照区及周围组织EB染色情况。 脑中EB定量检测大鼠超声辐照后尾静脉注射0.2%EB溶液，剂量为2mLkg?1,2h后用生理盐水灌
7、注，取脑，称重。将局部染色的脑组织按10mLg?1湿重浸入甲酰胺中，在60℃水浴中放置24h,当甲酰胺溶液呈蓝色、脑组织呈无色透明状时，取甲酰胺溶液测定620nm处的EB吸收度。EB的分光光度法测定线性范围为0.039~10μgmL?1.根据脑内EB浓度计算BBB的EB通透率[μg（EB）/g（脑组织）]. 磁共振常规及增强扫描磁共振（magicresonanceimaging,MRI）检查包括脑横断面及冠状面T1加权像（T1aging,T1Hz、焦距5cm、声强4R造影剂（Gd-DTPA）组；先
8、静注MR造影剂组后超声微泡组。对各组进行解剖后观察或T1加权相增强扫描，测定各组脑瘤部位及脑瘤边缘2mm内的EB浓度。 病理学观察取脑组织冠状切片，用常规石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察有无组织出血坏死表现。 统计分析实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用方差齐性检验、t检验。多组间数据比较采用方差分析，方差分析中两组间均数比较采用SNK法检
