部分野生稻之查尔酮异构酶基因家族分子进化

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1、部分野生稻之查尔酮异构酶基因家族分子进化第一部分综述1.1类黄酮生物合成途径简介类黄酮(Flavonoids)是植物中普遍存在的一类次生代谢产物，对植物本身而言，其在植物生理和生态等方面承担多样化的功能[1,2]，包括保护植物免受紫外线和病原体的侵害、吸引昆虫传粉、调节植物的雄性可育性、控制细胞周期以及指导生长激素的运输等；而从其经济利用的角度来看，类黄酮物质有重要的药理用途，主要能够治疗和预防如早期阿尔茨海默氏症、血管老年痴呆症、心血管疾病等以及许多其他严重威胁人体健康的疾病[3,4,5]。根据研究显示，饮食中

2、黄酮类化合物在进入肠道后，首先通过细菌糖苷酶的裂解，转化为易被吸收，同时具有生物活性的分子，然后在肝脏中与葡萄糖结合形成可溶性物质。类黄酮是目前研究较为清楚的苯丙烷类代谢途径合成的重要次生代谢物[6]。目前，已经报道类黄酮化合物种类已超过8000种，并且数目仍在继续增长。种类繁多的类黄酮都具有由两个芳香环（C6）被一个C3联接成15碳化合物的基本结构，即其基本骨架为C6-C3-C6，这也被称为黄烷核（图1-1）。芳香环A和芳香环B通过中间三碳链连接形成一系列化合物。根据中间C3的氧化程度不同，类黄酮可分为不同的种

3、类，如黄烷酮（flavonones）、黄酮醇（flavonols）、异类黄酮（isoflavonoids）和花色素苷（anthocyanins）等。另外，类黄酮的R1、R2、R3或R4位置可以进一步被修饰，如甲基化、酰化、羟化和糖苷化等。因而，自然界中存在种类繁多的类黄酮以及五彩缤纷的颜色。.1.2植物类黄酮合成途径中的查尔酮异构酶（chalconeisomerase）查尔酮异构酶(CHI;EC5.5.1.6)是类黄酮生物合成途径的关键酶之一[7]，通过迈克尔加成反应催化双环查尔酮分子内环化(图1-3)，使其转化

4、为具有生物活性的三环（2S）黄烷酮[8]，虽然这个反应可以是自发的，但是CHI催化可以使之效率提高107倍[9]。早期的研究表明查尔酮异构酶根据催化底物的不同可分为两种类型，类型Ⅰ查尔酮异构酶仅仅催化6-羟基查尔酮(6-hydroxychalcone)，并且在所有植物中都能找到，类型Ⅱ查尔酮异构酶不但可以催化6–羟基查尔酮(6-hydroxychalcone)，也可以催化6-脱氧查尔酮(6-deoxychalcone)，后一类型的查尔酮异构酶参与豆科植物中异黄酮的形成[10,11]。查尔酮异构酶（CH

5、I）的活性对于具有生物活性的黄烷酮的生成是至关重要的[12,13]。功能研究显示编码查尔酮异构酶基因缺失的大麦突变个体，嫩叶中类黄酮的含量将明显减少[14]。最近的一项研究结果显示洋葱的查尔酮异构酶（CHI）失活会导致植物中槲皮素浓度发生很大程度的降低[15]。另外，有报道显示在转番茄中与类黄酮合成有关的矮牵牛查尔酮异构酶基因的过量表达，将使果皮中黄烷酮浓度提高78倍，并且主要是以槲皮素苷的形式出现[16]。在乌拉尔草的研究中，其类黄酮的积累也与CHI基因的转录水平以及查尔酮异构酶的活性密切有关[17]。目前，查

6、尔酮异构酶（CHI）基因已从水稻、矮牵牛、葡萄、大麦、水母雪莲等物种中克隆得到[18,19,20]。然而，CHI基因调控和表达的研究仍然很少。在大多数植物中，查尔酮异构酶由单一基因编码，在矮牵牛中尽管发现有第二个CHI基因，但是它的产物似乎不参与类黄酮合成途径[18,21,22]。..第二部分药用野生稻查尔酮异构酶基因家族的生物信息学分析2.1材料和方法2.1.1转录组获得实验所需材料药用野生稻（O.officinalis)来自本实验室种植，样品号（104973）样品种子来自来自菲律宾国际水稻所种子库。提取植物总

7、RNA试剂盒使用TaKaRa生产的RNA提取试剂盒。2.1.1.2总RNA提取和mRNA的分离称取100mg新鲜叶片，依照第三部分材料和方法中RNA提取步骤提取总RNA，并测定浓度，RIN≥7，28S和18S的RNA的比值大于或等于1.5：1，起始量的范围为0.1-4ug。mRNA的分离包括mRNA纯化和片段化，首先用带有Oligod(T)的Beads对TotalRNA中mRNA进行纯化再根据不同的测序类型以及测序长度，选择合适的片段化程序将mRNA片段化到目标长度范围。.2.1.1.3dscDNA的合成d

8、scDNA的合成在合成在PCR仪型号为Biometra-TGRADIENT96进行，1stStrandcDNA合成体系为25ul，分别为分离的mRNA17μL，FirstStrandMasterMix(FSM)7ul，SuperScriptII1μL，PCR反应程序为25°C10min，42°C50min，70°C15min，4°