电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大鼠bcl

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1、电刺激小脑顶核对局灶脑缺血再灌注大鼠bcl【摘要】目的观察电刺激小脑顶核对局灶性缺血再灌注大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响，探讨电刺激小脑顶核中枢神经元保护的作用机制。方法大鼠大脑中动脉线栓法制作脑缺血再灌注动物模型，随机分为假手术组(SC组)，缺血再灌注组(I/R组)，缺血再灌注+电刺激齿状核组(DN组)，缺血再灌注组+电刺激小脑顶核组(FNS组)。RT-PCR和免疫组织化学法检测凋亡抑制蛋白bcl-xl与促凋亡蛋白bax的表达，用图像分析仪测定光密度值。结果I/R组与SC组比较，bcl-xl与bax的表达增高(P<0.05),与DN组比较，无显著差异(P>0.05)，予

2、以电刺激小脑顶核干预后，上调了bcl-xl的表达，bax的表达明显减少，与I/R组和DN组有显著差异(P<0.05)。结论电刺激小脑顶核增强局灶性缺血再灌注大鼠凋亡抑制蛋白bcl-xl的表达，下调促凋亡蛋白bax的表达，抑制局灶性缺血再灌注后神经细胞凋亡，可能是其中枢神经源保护作用机制之一。【关键词】电刺激小脑顶核;脑局灶性缺血再灌注;凋亡　研究发现，电刺激小脑顶核对脑局灶性缺血再灌注后神经损伤有保护作用，缩小梗死体积，减轻脑水肿的发生，其中枢神经源保护机制尚未完全阐明，可能与抗炎、抗凋亡有关〔1，2〕。细胞凋亡是缺血性脑血管病损伤级联反应病理过程中的重要环节，为缺血半暗带神经元死亡的

3、主要形式。脑缺血再灌注后神经元凋亡受一系列基因调控，调控过程涉及许多　基因的表达及相互影响。本实验通过观察电刺激小脑顶核对脑局灶性缺血再灌注后大鼠bcl-xl、bax蛋白表达的影响，探讨电刺激对小脑顶核的中枢神经元保护作用机制。　　1材料与方法　　1.1实验动物和分组健康雄性l/100g)腹腔注射麻醉大鼠后固定于脑立体定向仪上，沿颅骨中线剪开头皮，暴露前囟，根据大鼠脑立体定位图谱进行核团定位，DN定位：前囟后11.6mm，左旁开3.0mm，深度6.5mm;FNS定位：前囟后11.6mm，左旁开1.1mm，深度5.6mm。钻开颅骨后，插入双极同心圆电极(100μm，重庆医科大学生理学教研室),

4、予强度50μA，频率70Hz，时程0.5ms的电刺激，在刺激过程中动物始终处于浅麻醉状态。　　1.3免疫组织化学染色法检测bcl-xl和bax表达灌注固定后，断头取脑。冠状切取视交叉后部脑组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片脱蜡、水化，30g/LH2O2室温10min灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次;滴加正常血清封闭液，室温20min，甩去余液;不同的切片分别适量加入羊抗大鼠bcl-xl和bax抗体(均购于北京中杉生物公司)，4℃湿盒内过夜。滴加生物素化二抗，37℃20min;然后滴加链霉亲合素-生物素-过氧化氢酶复合物37℃20min。用DAB显色，常规脱水、透明、封片。应用Im

5、age-proplus5.0图像分析软件计算平均光密度值(OD)，每只大鼠取三张切片采集免疫组化染色图像，在400倍下，每张切片随机取5个视野进行图像分析，并行平均光密度值测定分析。　　1.4逆转录聚合酶链反应法检测bcl-xl和bax表达提取各组大鼠脑组织总RNA并定量，用DNAaseI处理总RNA以去除DNA污染,各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR。bcl-xl引物正义链：5′-GTGCGTGGAAAGCGTAGACA-3′，反义链：5′-CAGCCAAGGTGACCCATTAC3′，产物长度465bp。内参β-actin引物正义链：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGA

6、CC-3′，反义链：5′-GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，产物长度648bp。bax引物正义链：5′-TTCATCCAGGATCGAGCAGA-3′;反义链：5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′;产物长度457bp。内参β-actin引物正义链：5′-CTGGTGGACAACATCGCTCT-3′;反义链：5′-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3′,产物长度349bp。PCR反应条件：9　5℃变性5min;95℃30s，58℃30s，72℃1min,循环35次;72℃延伸7min。将PCR扩增的产物5μl在20g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一

7、般为70～80V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用QuantityOne-4.4.0软件行定量分析，以目的基因与β-actin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。　　1.5统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS12.0统计软件，根据方差齐性与否分别采用参数检验和非参数检验，齐性资料的多组间及组内之间比较均采用单因素方差分析，非齐性资料用秩和检验。　　2结果　　2.1免疫组