肠球菌溶血素的表型及基因型检测

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1、肠球菌溶血素的表型及基因型检测【摘要】目的观察大鼠全脑照射后海马区肿瘤坏死因子α（TNFα）的动态表达，探讨其在放射性脑损伤急性期的反应发病机理中可能的作用。方法制备大鼠的脑放射诱导损伤模型。利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术半定量分析大鼠脑放射诱导损伤后海马区在不同时间、不同剂量水平TNFα基因转录的动态表达。结果正常组海马区TNFαmRNA低水平表达；全脑照射组表达上调并在1h达峰值，是正常组的4～11倍（P<0.001）；放射诱导呈剂量依赖性（P<0.01），30Gy组

2、较2Gy组增高近2倍（P<0.001），较15Gy组增高近1倍（P<0.01），15Gy组也高于2Gy组；各照射组在12h后恢复到基础水平。结论大鼠全脑照射后海马区TNFα基因表达上调，放射诱导呈剂量依赖性，提示参与了脑放射诱导损伤急性期的细胞反应。【关键词】肿瘤坏死因子α脑损伤海马疾病模型动物放射性脑损伤是头颈部肿瘤提高放射治疗疗效的重要障碍之一，一些亚急性期和晚期并发症的影像学和组织学变化已比较明确，但急性期的细胞和分子反应以及如何进展为晚期损伤的机理目前尚不清楚。已有实验证实诱发脑

3、损伤的一个重要因素是细胞因子的过度表达，损伤特征性变化如脑水肿、神经胶质增生及脱髓鞘都与前炎性细胞因子的产生密切相关[1]。肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种典型的细胞因子，在各种损伤反应的分子网络中都有重要作用，如在脑放射诱导损伤各反应期都可观察到与其它细胞因子不同的变化[2]。笔者观察大鼠脑放射诱导损伤后海马区TNFαmRNA的动态表达，探讨其在放射性脑损伤早期的反应机制中可能的作用。1材料与方法1.1动物1.1.1模型制作6～8周龄SD雌性大鼠100只由厦门大学动物中心提供[动物合格证号为SC

4、XK（沪）20040005]，体质量(200±20)g。脑放射诱导损伤模型参照文献[3]制作。3.6%水合氯醛按1mL/100g麻醉，予直线加速器4MeV电子线全脑照射，照射范围包括双眼至耳根区域。1.1.2分组按不同单次照射剂量2，15，30Gy和照射后不同观察时间1，6，12，24，48h和7d分为18组，另设假照射组（麻醉后不进行照射）和正常组（不麻醉不照射）为对照，共计20组，每组5只。断头处死后随机取一侧海马，立即置于无RNA酶的Ep管中，-196℃液氮保存。1.2方法1.2.1总RNA的

5、提取按说明书用Trizol试剂(上海生物工程公司)提取总RNA。经紫外分光光度计测定D（260nm）/D（280nm）在1.7～2.0，计算总RNA含量，电泳证实18S和28S条带清晰。1.2.2逆转录合成cDNARNA2μg以Oligo(dT)18为引物，20μL反应体系在70℃预变性5min；再加入5×RTbuffer、dNTP、RNasin和MMLV共40μL，体系在37℃反应45min。1.2.3PCR扩增取cDNA5μL用于扩增。50μL反应体系中加入10×buffer、MgCl2、dNTP

6、、TaqDNA聚合酶、正义和反义引物。PCR的反应条件为94℃30s→60℃30s→72℃60s，共33个循环。以βactin为内参照，扩增产物7.5μL和βactin5μL混合在1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果采用计算机数字扫描密度影像分析仪进行半定量分析。PCR所采用的引物根据Genebank及软件设计,由上海生物工程公司合成。序列如下：TNFα（438bp）：F：5′GGTGATCGGTCCCAACAAGG3’R：5′CCTCCCAGGTACATGGGCTC3’βactin（332bp）：F

7、：5′CTGGAGAAGAGCTATGAGC3’R：5′AGGATAGAGCCACCAATCC3’1.3统计学处理以内参照βactin光密度值标化TNFα光密度值，得到TNFα的相对含量，结果用x±s表示。应用SPSS11.0软件进行统计分析。对时间和照射剂量作双因素F检验，对有显著差异组样本均数作t检验。3讨论大脑肿瘤的放射治疗可能会伴随发生亚急性和晚期并发症的危险，其病理特征是脱髓鞘、神经元缺失、脉管系统损害和神经胶质增生。并发症的程度因照射剂量、靶体积、人种和其他因素的不同而不同。尽管这些

8、并发症在照射后需要一定的时间才有表现，但在无症状期观察到的细胞反应可能对决定这种最终结果发挥重要作用[2,4]。动物模型显示放射可以诱发脑内周期性的细胞级联变化，包括持续数天至数月的神经胶质增生、导致脱髓鞘变化的少突胶质细胞缺失及血脑屏障损害,这些变化都与前炎性细胞因子的产生密切相关[1]。TNFα作为一种重要的前炎性细胞因子在上述条件下均可观察到明显的变化，故目前一致认为它参与了损伤与修复过程[5]。已有的文献资料认为，鼠脑放射的平均致死剂量（LD5