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1、川芎嗪对小鼠小细胞肺癌血管生长和VEGF表达的抑制【关键词】川芎嗪小细胞肺癌微血管密度血管内皮生长因子恶性肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤组织中新血管生成,抑制血管生成能抑制肿瘤的生长和转移[1]。肿瘤细胞能够分泌多种血管生成因子,其中血管内皮生长因子(VEGF)是高效、高特异性作用于血管内皮的促血管生成因子,与肿瘤的生长和转移密切相关[2]。川芎是著名的活血、化瘀、抗肿瘤中药。已知川芎嗪可以抑制肿瘤的生长,其机制与其促进免疫功能有关[3]。川芎素(阿魏酸钠)抑制人肺癌A549细胞增殖,其机制与诱导细胞凋亡有关[4]。本试验观察川芎嗪对小鼠小细胞肺癌的抑制
2、作用以及对肿瘤微血管密度和VEGF表达的影响,旨在探讨活血化瘀中药可能存在的其它作用及其机制。1材料与方法1.1药品与试剂盐酸川芎嗪注射液（TMP，4mg/2mL/支，北京市第4制药厂）,硫酸鱼精蛋白注射液(PTM,50mg/5mL/支,上海生物化学制药厂),VEGF抗体和Ⅷ因子抗体（SantaCruze产品），SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其余试剂均为市售分析纯。1.2动物分组与造模[5]取40只18～20g的C57BL小鼠(购自中国医科大学实验动物中心),雌雄各半,随机分为4组，川芎嗪1、2组、鱼精蛋白组(阳性对照)、生理盐水组(
3、NS)。取接种小细胞肺癌细胞（购自中国科学院细胞库)14d的C57BL荷瘤小鼠脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织加生理盐水研磨成匀浆,调细胞浓度后,每只正常C57BL小鼠右臀部皮下接种1×107个小细胞肺癌细胞。1.3实验方法川芎嗪组剂量分别为100、200mg/kg,生理盐水组每只0.2mL,接种后第2天开始用药,每天1次,腹腔注射连续21d;鱼精蛋白组60mg/kg,接种后第2天皮下注射1次,第3天起每12小时1次,连续20d。第22天脱颈椎处死各组小鼠进行检测。1.4一般检测接种前和接种后每3天称量1次体重,按体重变化调整给药剂量。接种后每3天用游
4、标卡尺测量1次荷瘤小鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b),按V=0.5ab2计算肿瘤体积,第22天处死小鼠,取接种部位肿瘤称重,计算肿瘤生长抑制率〔肿瘤生长抑制率(%)=(生理盐水组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%〕。1.5免疫组化染色取肿瘤组织,固定、脱水、包埋,4μm连续切片,VEGF抗体或Ⅷ因子抗体为Ⅰ抗,阴性对照用PBS代替Ⅰ抗,按照试剂盒说明书进行SABC法免疫组织化学染色。1.6VEGF表达的定量分析选取阳性细胞密集区域,在400×显微镜下选取20个阳性细胞,用图像分析系统测定平均吸光度(A值),以此代表阳性细胞胞质
5、单位面积内VEGF相对含量。1.7肿瘤微血管密度分级（MVD)依据SF,21mg/Laorotinin,0.5mg/Lleupeptin,1%SDS)，离心后将上清液移于另一试管中。Lomol/LTris-HCl，20%甘油,0.01%溴酚蓝,4%SDS,200mmol/LDTT)，置沸水浴中加热5min,按每孔30μg蛋白量加样进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶在转移缓冲液(25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸,20%甲醇)中转移至硝酸纤维素膜,然后将膜浸没于含5%脱脂奶粉的TBST液中封闭。Ⅰ抗、Ⅱ抗分别与膜孵育,显影,NIHim
6、age1159计算机软件分析条带。川芎嗪各剂量组、鱼精蛋白组肿瘤体积均小于生理盐水组(均P<0.05),见图1。结果显示:川芎嗪对C57BL小鼠小细胞肺癌实体瘤生长有抑制作用。图1川芎嗪对各组肿瘤生长体积的影响2.2川芎嗪对肿瘤重量及生长抑制率的影响川芎嗪各个剂量组、鱼精蛋白组小鼠接种部位的肿瘤重量均低于生理盐水组(均P<0.05)，见表1。实验结果显示:川芎嗪对C57BL小鼠小细胞肺癌实体瘤生长有抑制作用。表1川芎嗪对肿瘤重量及肿瘤血管生长的影响注：*P<0.05，**P<0.01vsNS2.3川芎嗪对肿瘤细胞VEGF表达及
7、肿瘤血管生长的影响图像分析显示:VEGF主要表达于肿瘤细胞内,阳性染色的肿瘤细胞多位于浸润边缘。血管内皮细胞呈弱阳性染色。川芎嗪各剂量组VEGF表达都呈现出弱阳性,各组A值与生理盐水组比较,差异有显著性（P<0.05)，见表2。实验结果显示:川芎嗪对C57BL小鼠小细胞肺癌细胞表达VEGF有抑制作用。图像分析显示:肿瘤组织切片中,微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位。不同剂量的川芎嗪组肿瘤血管密度分级MVD值低于生理盐水组(均P<0.05)，见表2。实验结果显示:川芎嗪对C57BL小鼠小细胞肺癌实体瘤血管生成有抑制作用。表2川芎嗪对肿
8、瘤血管生长的影响注：*P<0.05，**P<0.01vsNS2.4VD)的增加而明显增加[10]
