质粒dna限制性酶切图谱分析

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1、一、DNA的限制性酶切实验原理实验三质粒DNA限制性酶切图谱分析核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DN

2、A结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个

3、碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1.限制性内切酶的类型一、DNA的限制性酶切实验原理粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G

4、AATTC……3’3’……CTTAA

5、G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补

6、的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT

7、ATC……3’3’……CTA

8、TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶

9、，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。2.限制性核酸内切酶的命名法一、DNA的限制性酶切实验原理由pUC18改造而来，大小为3162bp。相当于在pUC18中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、琼脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖凝胶电泳法分

10、离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。二、琼脂糖凝胶电泳实验原理（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。琼脂糖电泳的优点配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据

11、被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围常用的电泳缓冲液4℃保存备用.常用的6X载样缓冲液Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液三材料、设备及试剂质粒：pUC118、pEGFP设备：eppendorf管、微量取液器，台式高速离心机，电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉试剂：琼脂糖、TAE电极缓冲液、LamdarDNAEcoRI/HindⅢ、EB