混合脐血移植可重建scid小鼠造血和免疫功能

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1、混合脐血移植可重建SCID小鼠造血和免疫功能-->混合脐血移植可重建SCID小鼠造血和免疫功能【摘要】：目的　探讨混合脐血移植重建造血和免疫功能的特点及规律。方法　分别将两份人HLA半相合、不相合混合脐血或单份脐血输入经亚致死量照射后的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。观察三组脐血在SCID小鼠体内植入状况及造血和免疫功能重建特性。结果　单份和混合脐血均可在受鼠体内植入,形成供-受混合嵌合体,植入率差异无显著性(P>0.05),并能重建人类多系造血,且易于向NK和B淋巴细胞方向分化。用多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸(PCR-SSO)探针检测人HLA-DQB1基因发现,混合脐血

2、移植可有1份或2份脐血植入,其中造血祖细胞含量和体外集落形成能力高者,更易于植入,且供者间HLA差异小者,趋向两份脐血同时植入。结论　混合脐血移植可重建SCID小鼠造血和免疫功能,但造血细胞各谱系分化不均衡。【关键词】：脐带血;移植;血液和免疫系统研究发现,造血干细胞移植(HSCT)后常存在一定程度的免疫缺陷状态,使受者对各种微生物的易感性增加,易患致命性细菌、霉菌及病毒感染[1]。脐血作为造血干细胞的,用于移植和基因治疗已备受关注。以往研究证实,脐血移植后,移植物抗宿主病(GVHD)较轻,但髓系和血小板恢复相对延迟,这与移植的脐血细胞较骨髓及外周血数量少有关[2]。脐血有限的

3、造血干/祖细胞数量限制了其在成人中的应用。为此,近年来人们开展了有关混合脐血移植方面的研究,以期提高移植所需的造血细胞数量,扩大其临床应用范围。我们在既往的基础和临床研究基础上[3-5],利用人-SCID鼠脐血移植模型,对混合脐血移植的可行性及造血、免疫重建特性进行了较全面的研究,现报告如下。材料与方法1.实验动物:联合免疫缺陷(SCID)小鼠(H-2d/Hh-1d),购自中国医学科学院实验动物研究所,5~7周龄,体重16.5~23g,雌雄不限。饲养于无菌层流柜中,饮水及垫料均经高压灭菌。饲料经60Coγ射线照射。移植前1周及移植后2周,饮水中加庆大霉素和红霉素。2.脐血:人脐

4、血取自本院产科正常足月儿,CP-DA抗凝,平均采集量60~110ml,4℃存放不超过24h。留取部分标本进行HLA-A、B、DR分型及病原学检测。余脐血经PBS缓冲液稀释,Ficoll(相对密度1.077)梯度离心法分离单个核细胞(MNC),RPMI1640制成MNC悬液,分装于低温无菌冷冻管中,加入冷冻保护剂,体积分数为10%DMSO(二甲基亚砜)、20%FBS(小牛血清),混匀后置液氮深低温冻存。移植前将脐血标本置于37℃水浴箱中快速冻融,RPMI1640洗涤,行细胞计数、台盼篮染色、造血祖细胞培养及CD34+、CD38+细胞含量测定。3.造血祖细胞集落培养:采用甲基纤维素

5、半固体培养法,将移植前脐血(细胞数2×105个)或移植后小鼠骨髓MNC接种在MethocultTMGFH4435培养基(StemCellTech公司;内含9g/L甲基纤维素,300g/L胎牛血清,10g/L牛血清白蛋白,10-4mol/L2-巯基乙醇,2mmol/LL-谷酰胺,50ng/ml重组SCF,20ng/mlrhGM-CSF,20ng/mlrhIL-3,20ng/mlrhIL-6,20ng/mlrhG-CSF,3units/mlrhEPO)中,每孔1ml,复种3孔,37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度的培养箱中培养14d,分别计数CFU-GM和BFU-E。4.SCI

6、D小鼠移植:将6~8周龄SCID小鼠随机分为HLA半相合混合脐血移植组(半相合组)、HLA不相合混合脐血移植组(不相合组)及单份脐血移植组(单份组)。移植前经6MVX线直线加速器全身一次性照射300cGy。照射后2~4h内分别从尾静脉注入200μl混合脐血或单份脐血MNC悬液。根据以往研究报道[6],单份组每只小鼠移植细胞数为1×107,混合组两份脐血移植细胞数量分别为5×106,使各组输入细胞总数相等。并设阴性对照组(未移植组)。四组SCID小鼠分别为16只、15只、10只和7只。对移植后死亡小鼠的肝、脾、肺、肠等组织作病理切片检查。本研究共用了3份脐血(CB1,CB2,CB

7、3),单份组为CB1;半相合组为CB2+CB3;不相合组为CB1+CB3。5.流式细胞仪分析细胞表面标志:采用美国BectonDickinson公司FACScan流式细胞仪及标记鼠抗人单克隆抗体:FITC-CD45、PE-CD34、FITC-CD38、PerCP-CD3、PE-CD4、PE-CD8、PE-CD13、PE-CD16、PE-CD19、PE-CD56、PE-CD41。用单色或双色直接免疫荧光标记法,向收集的细胞中加溶血素裂解脐血(CB)、小鼠骨髓(BM)、脾脏、胸腺及外周血(PB)