人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建实验的研究

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1、第三军医大学硕士学位论文人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究摘要造血微环境（hematopoieticinductivemicroenvironment，HIM）是支持和调节造血干/祖细胞（haemopoieticstem/progenitorcell，HSPC）生长发育的内环境，其结构和功能的完整统一是维系造血功能正常进行的重要环节。作为造血微环境的重要组成部分，基质细胞可能通过形成造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）生长的“龛”，分泌造血生长因子（hematopoieticgrowthfactor，HGF）和细胞外基质（ex

2、tracellularmatrix，ECM）等参与造血细胞的自我更新、增殖分化和归巢定位，在免疫调节方面也具有重要的作用。深入探讨基质细胞对骨髓造血功能的影响，从修复或重建骨髓微环境正常功能入手治疗造血功能损伤具有重要的理论价值和实际意义。基质细胞由间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）分化而来，是一个包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和网状细胞等成分复杂的异质细胞群。自1977年Dexter在体外培养出人骨髓基质细胞（humanbonemarrowstromalcells，hBMSCs）获得成功后，人们对hBMSCs进行了深入的研究。经实验

3、研究和临床实践证实，hBMSCs体外培养扩增联合HSC回输是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs来源受限，采集骨髓增加供者痛苦和风险，且细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄增加而下降。自体移植中患者自身基质细胞存在异常，而异体移植亦有可能带来移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease，GVHD）等免疫相关问题，均限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。人脐血来源丰富，取材方便，具有未成熟的干/祖细胞比例高且免疫原性较低等特点，在多种造血系统恶性疾病临床治疗中具有潜在的应用价值。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（humanumbilicalcordblood-deriv

4、edstromalcells，hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究，前期研究通过特定的细胞因子使hUCBDSCs得以有效扩增，扩增后的hUCBDSCs在细胞成分和免疫表型上与hBMSCs相似，能够分泌表达多种细胞因子，具备造血基质细胞的基本特征。以hUCBDSCs为滋养层的培养体系能有效支8第三军医大学硕士学位论文+持脐血CD34细胞体外扩增，特别对于促巨核细胞集落形成单位（colonyformingunit-megakaryocte，CFU-Mk）形成的作用明显优于hBMSCs，提示hUCBDSCs在促进巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意义。深入探讨hUCBDSCs移植在体内

5、支持和调控造血、重建造血微环境的作用可为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。基于上述分析，本课题首先建立两种不同来源基质细胞滋养层（hUCBDSCs和hBMSCs）培养体系，采用CCK-8法和Transwell法分别观察两种基质细胞对脐血单个核细胞（humanumbilicalcordmononuclearcells，hUCB-MNCs）增殖、粘附和迁移的影响，并采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关分子mRNA的表达情况。在此基础上建立BABL/c小鼠造血微环境辐照损伤模型，采用hUCB-MNCs单移植，或分别联合两种不同来源基质细胞共移植的方法，比较观察两种基质细胞促进造血

6、细胞体内归巢与植入、重建造血微环境及支持造血重建的作用，为安全有效的临床移植治疗提供新的辅助措施和手段。方法：1.体外构建hUCBDSCs和hBMSCs两种不同来源基质细胞滋养层培养体系。采用CCK-8法和Transwell法分别检测两种基质细胞对hUCB-MNCs体外增殖、粘附和迁移的影响；采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关因子（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA的表达情况。602.以近交系BABL/c小鼠作为受体鼠，经COγ射线致死剂量8.5Gy全身照射6预处理后分别接受不同剂量hUCB-MNCs（2、4、6

7、或8×10/只）单移植，或联合6+hUCBDSCs（2×10/只）共移植，移植后第6周流式细胞仪检测小鼠骨髓人源CD45细胞植入率。3.采用CM-DiI荧光染料预染hUCB-MNCs，辐照后BABL/c小鼠分别接受66hUCB-MNCs（2×10/只）单移植，或联合两种不同来源基质细胞（2×10/只）共移植。激光共聚焦显微镜追踪观察移植后荧光标记hUCB-MNCs在小鼠体内的迁移分布情况，比较各组造血细胞归巢率。64.辐照后小鼠分别接受hUCB