半胱氨酸酶在ns398诱导hepg2细胞凋亡中的作用

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1、半胱氨酸酶在NS398诱导HepG2细胞凋亡中的作用【】目的探讨选择性环氧合酶(cox2)抑制剂ns398诱导肝癌hepg2细胞凋亡的分子机制。方法采用流式细胞术测定细胞凋亡情况;ol/l)作用hepg2细胞24h后,对照处理组没有出现凋亡峰,其余各组(100、200、300、400μmol/l)出现明显的凋亡峰,其凋亡率分别为(10.51±1.04)%、(27.79±2.40)%、(45.72±3.32)%,(60.22±2.03)%(p0.01),不同浓度ns398处理后凋亡相关蛋白bcl2表达下降,c

2、aspase3蛋白表达增加,随着ns398处理浓度的增加,表达活性caspase3的细胞百分率分别为(2.67±0.22)%、(9.53±0.15)%、(21.28±0.43)%、(39.63±0.8)%、(63.40±0.69)%(p0.01)。结论选择性cox2抑制剂可能通过调节bcl2蛋白表达活化caspase3,从而诱导肝癌细胞hepg2凋亡。【关键词】环氧水合酶类;caspase3;bcl2;凋亡;hepg2significanceofcaspaseinns398inducedapoptosiso

3、fhepg2celllinehudongxiadepartmentofhematologyandoncology,hospitalaffiliatedtoorhepg2cellline.methodscellapoptosisisdeterminedbyfloetryanalysisusingpistaining.theexpressionofbcl2andcaspase3proteinetry.resultsselectivecox2inhibitorns398cansignificantlyinducea

4、poptosisofhepg2cellslinesignificantly.floetryassayrevealedtheapoptoticrateofhepg2cellstreatedol/l)ayactivatecaspase3bydoi1640（美国sigma公司）,鼠抗人bcl2、caspase3单克隆抗体(美国santacruz公司),rnase、1kbdnaladder、碘化丙啶(pi)和caspase3活性检测试剂盒（深圳晶美公司)。1.2细胞培养人肝肿瘤细胞株hepg2购自上海科学院细胞中心。在含有

5、10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及链霉素100u/ml的rpmi1640培养基中37℃、5%co2条件下培养箱中贴壁培养,每48h换液传代一次,取生长良好，细胞活性大于98%的细胞进行实验。1.3细胞周期测定将终浓度为100、200、300、400μmol/l的ns398与肝癌细胞作用24h后,0.25%胰酶消化,收集制成1×105个细胞的单细胞悬液,收集六孔板内细胞制备单细胞悬液。磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次,70%冰乙醇固定。检测时以pbs洗2次,加入200μlrnasea(1g/l),37℃水浴30m

6、in,再加pi染色液避光反应30min,上机检测,multicycle软件分析亚二倍体峰。1.4细胞蛋白质样品制备及蛋白定量hepg2细胞bcl2和caspase3蛋白质表达:以1×106个hepg2细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入不同浓度的ns398的使其终浓度分别为100、200、300、400μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。经处理后的细胞立即弃去培养液,洗涤,离心。加预冷的细胞裂解液(0.1mol/lnacl,0.01mol/ltrishcl,ph7.6,0.001mol/le

7、dta,100μg/mlpmsf,2μg/mlleupeptin)0.1ml,裂解30min,然后与10000g离心10min,取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白,并调各组蛋白浓度一致。1.5in，再用二抗（1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠igg）震荡孵育2h。洗去未结合的二抗，滴加ecl化学发光试剂，x线片曝光显影。扫描x线片，计算机软件处理，软件进行扫描定量,每个浓度组重复3次,取均值代表测定结果。1.6caspase3活性检测采用activecaspase3apoptosisk

8、it检测caspase3活化情况。不同浓度ns398(0、100、200、300、400μmol/l)处理的hepg2细胞六孔板内培养24h后,收集细胞制备单细胞悬液,1.5mlpbs清洗后加破膜剂a100μl,避光孵育15min后,以2mlpbs清洗,1800r/min离心5min,弃上清,加入100μlb液+caspase3pe抗体或同