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1、PCDNA疫苗pVAX肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia,PC)是各种先天或后天免疫机能低下者常见的并发症和主要的死亡原因之一.复方磺胺甲唑作为目前预防和治疗PCP的主要药物,由于其毒副作用及耐药性问题受到了一定程度限制.因此,寻找更为安全及有效的防治措施成为目前研究PCP的一个焦点.P55抗原是肺孢子菌细胞壁分子量为45~55kD的组分抗原,它能刺激宿主产生保护性免疫反应[1].Ma等[2]发现p55抗原基因存在多态性并克隆了p55-v1~4抗原基因,并将Smulian等[3]克隆的p55抗原基因命名为p55-v0,比较发现p55-v3与p
2、55-v0在结构和染色体位置上均存在差异.本课题组前期已成功克隆出p55-v3与p55-v0抗原基因,序列比对发现p55-v3和p55-v0同源性仅为20.9%[4].那么机体感染PC过程中,p55-v3能否刺激宿主产生保护性免疫反应,尚无研究证实.本研究在成功构建PCDNA疫苗pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0基础上[5],免疫SD大鼠并诱导PC感染,比较观察肺重/体重、肺印片包囊计数及组织病理学,从而对p55-v3抗原的免疫保护作用提供依据.1材料与方法1.1主要试剂、质粒及菌株质粒抽提试剂盒(大抽)购自Omega公司.感受态大肠杆菌DH5&alp
3、ha;购自北京鼎国生物技术有限公司.真核表达载体pVAX1购自Invitrogen公司.pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0由本实验室自制.1.2质粒的抽提(大抽)挑取pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0、pVAX1单菌落,分别接种于LB/Kna培养基中,按质粒抽提试剂盒(大抽)说明书进行抽提,核酸蛋白分析仪测定质粒浓度及纯度.1.3动物免疫40只SD雌性大鼠,分为4组(A组PBS对照组、B组pVAX1免疫组、C组pVAX-p55-v0免疫组、D组pVAX-p55-v3免疫组),分别肌肉注射DNA疫苗100μg,每15天免疫1次,共免疫4
4、次.末次免疫15d后,按照文献[6]报道建立PCP动物模型,诱导PC感染.1.4疗效考核实验前后均记录各组大鼠体重.实验完毕,处死大鼠,取肺分离气管及肺门组织,吸干表面水分后称全肺湿重.将每只大鼠的4个肺叶上下横断,印于5张载玻片上印片,每张印片编号.空气干燥,甲醇固定,六亚甲基四胺银(GMS)染色,油镜下顺序观察100视野,计数PC包囊数,计算每视野包囊均数,再计算每组包囊均数.取左肺上部分小块组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,制成切片,经HE和GMS染色后观察.参照Kim等[7]提供的方法,按所涉及的肺泡数确定PC感染的程度.1.5统计学分析实验数据用x-&pl
5、usmn;s表示,组间数据结果分析采用单因素方差分析,使用SPSS10.0统计学软件进行分析,P<0.05为统计学差异显著.2结果2.1大鼠体重及肺重/体重的变化地塞米松注射6周后,pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0免疫组体重增加,肺重(g)/体重(g)明显降低(0.96±0.15/0.83±0.14vs1.59±0.32/1.68±0.38),P<0.05,而pVAX-p55-v3组与pVAX-p55-v0组无显著性差异(P>0.05).2.2肺印片包囊均数比较pVAX-p55
6、-v0及pVAX-p55-v3免疫组每视野包囊均数明显低于pVAX1及PBS对照组(0.95±0.45、1.75±0.98vs5.76±1.42、5.90±1.03),P<0.05.从图1A~C、d亦可见pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫组包囊数明显减少.2.3肺组织病理学观察2.3.1HE染色pVAX-p55-v0及pVAX-p55-v3免疫组肺切片(HE染色),肺实变较对照组明显减轻,肺泡腔内渗出减少,见图1E、F、G、H.2.3.2GMS染色采用GMS染色,PBS及pVAX1对照组
7、(图1I、J)肺切片可见被染成棕黑-黑色的PC包囊散在或成堆地存在于肺泡腔中或贴在肺泡壁上,肺泡间质中亦可见少量包囊.而实验组包囊数量均明显减少(图1K、I).3讨论P55是卡氏肺孢子菌细胞壁上的一种组分抗原.Smulian等[1,3]克隆并鉴定了肺孢子菌55kD抗原基因(p55-v0),将重组P55抗原主动免疫大鼠后能够刺激机体产生体液和细胞免疫反应.Ma等[2]分别克隆了p55-v1~v4基因,比较发现p55-v3和p55-v0基因3端均为高度保守区域,但两者重复区域的氨基酸种类和数目存在差异;p55-v0包含一个N-连接糖基化位点和RGD连接位点而p55-v
8、3没有;染
