防龋基因疫苗pvax1-spapp、pvax1-gbpagbd和pvax1-spapp-gbpagbd经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究

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1、遵义医学院硕士学位论文防龋基因疫苗pVAX1--SpaP/P、pVAX1--Gbpa/GBD和pVAX1--SpaP/P--GbpA/GBD经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究姓名：余超申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：刘建国201205遵义医学院硕士学位论文防龋基因疫苗pVAXl—SpaP／P、pVAXl—GbpA／GBD和pVKXl一SpaP／P-GbpA／GBD经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究防龋基因疫苗pVAXl一SpaP／P、pVAXl．GbpA／GBD和pVAXl一SpaP／P．GbpA／GBD经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究中文摘要目的：观

2、察防龋基因疫苗pVAXl一SpaP／P、pVAXl-GbpA／GBD和pVAXl．SpaP／P．GbpA／GBD经股四头肌肌肉注射、颌下腺区皮下注射和鼻腔黏膜滴注免疫新西兰大白兔后的免疫效果，探索最佳的免疫途径，观察所用基因疫苗对免疫动物一般安全性指标的影响。方法：本研究包括两部分：实验一：重组质粒pVAXl一SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl．SpaP／P．GbpA／GBD及载体质粒pVAXl的鉴定和大量制备。1．先小量抽提储存的重组质粒pVAXi．SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl-SpaP／P-GbpA／GBD及载体质粒pVAX

3、l。2．限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pVAXl一SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl-SpaP／P-GbpA／GBD及载体质粒pVAXl是否正确。3．在鉴定正确的基础上，大量抽提重组质粒pVAXl·SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl一SpaP／P—GbpA／GBD及载体质粒pVAXl，利用紫外分光光度计测定所抽提质粒的OD值，并计算其浓度和纯度，贮存以备免疫动物。实验二：基因疫苗pVAXl．SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl一SpaP／P—GbpA／GBD免疫新西兰大白兔。1．动物选择与分组：A大组：9R1．5埏新西

4、兰大白兔，随机分为3组，每组3只。A1组·pVAXl．SpaP／P股四头肌注射组；A2组：pVAXl一SpaP／P颌下腺区皮下注射组；A3组：pVAXl．SpaP／P鼻腔黏膜滴注组。B大组：9只1．5kg新西兰大白兔，随机分为3组，每组3只。B1组：pVAXl-GbpA／GBD股四头肌注射组；B2组：pVAXl一GbpA／GBD颌下腺区皮下注射组；B3组：pVAXl-GbpA／GBD鼻腔黏膜滴注组。C大组：9只1．5kg新西兰大白兔，随机分为3组，每组3只。C1组：pVAXl．SpaP／P--GbpA／GBD股四头肌注射组；C2组：pVAXl一SpaP／P．GbpA／GBD

5、颌下腺区皮下注射组；C3组：pVAXl一SpaP／P—GbpA／GBD鼻腔黏膜滴注组。D大组(对照组)：6只1．5埏新西兰大白兔，随机分为2组，每组3只。D1组(阴性对照组)：pVAXl股四头肌注射组；D2组(空白对照组)：生理盐水股四头肌注射组。2．免疫时间：共免疫3次，首次免’遵义医学院硕士学位论文防龋基因疫苗pVAXl—SpaP／P、pVhXl一GbpA／GBD和pVAXI—SpaP／P-GbpA／GBD经不同途径免疫新西兰大白兔的实验研究疫后间隔1周以同样剂量加强免疫1次，再间隔2周进行第2次加强免疫。3．样品及数据采集时间：分别于免疫前1天和免疫后第1，2，3，4

6、，6，8，10，12，14，16周收集血清和唾液样本，每次采样之前对动物进行称重并记录。4．特异性抗体的检测：血液和唾液中IgG和IgA特异性抗体采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测。5．动物脏器的病理学检查：第16周采集血液及唾液后，称重并处死动物，解剖并分离其心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行称重，计算脏器系数，并进行组织病理学检查。观察实验组与对照组各器官大体形态及其组织结构有无异常变化。结果：①在重组质粒小量抽提、鉴定无误的基础上，应用宏量质粒纯化试剂盒抽提出高纯度、高浓度的质粒。②经酶联免疫吸附实验证明，免疫后血清IgG型特异性抗体和唾液S-IgA型特异性抗

7、体水平均明显升高，并持续数周。且鼻腔黏膜滴注组和颌下腺区皮下注射组诱导动物产生免疫反应生成的唾液s．IgA型特异性抗体水平比肌肉注射组高。③对各组实验动物的器官大体形态以及各器官病理组织切片观察，未发现明显异常。经对脏器系数进行统计学分析，未发现重组质粒pVAXl．SpaP／P、pVAXl一GbpA／GBD和pVAXl一SpaP／P—GbpA／GBD对新西兰大白兔有明显毒性作用。结论：①基因疫苗pVAXl．SpaP／P、pVAXl．GbpA／GBD和pVAXl．SpaP／P—GbpA／GBD可以诱导新西兰大白兔产生