资源描述：
《在牙胚发育晚期shh可能参与了成釉细胞和成牙本质细胞分化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、在牙胚发育晚期Shh可能参与了成釉细胞和成牙本质细胞分化-->【摘要】口腔医学论文代写目的:观察信号分子Sonichedgehog(Shh)在小鼠下颌第一磨牙牙胚发育晚期的基因表达,探讨其在成釉细胞、成牙本质细胞分化中的作用。方法:制备昆明小鼠磨牙牙胚发育晚期(E16.5~P1.5)标本,用原位杂交法分析ShhmRNA在牙胚中的表达和分布。结果:ShhmRNA在牙胚发育晚期的前成釉细胞和中间层细胞呈阳性表达,在成牙本质细胞层表达较弱。结论:在牙胚发育晚期,Shh可能通过自分泌途径和旁分泌途径,参与了成釉细
2、胞和成牙本质细胞分化。【关键词】信号分子;Sonichedgehog(Shh);牙胚发育晚期;基因表达;原位杂交;小鼠 哺乳动物牙齿发育过程中,外胚上皮和外胚间充质的相互作用调控了细胞生长和分化,最终成长为具有特定形状、大小和功能的器官。上皮-间充质相互作用的实现依赖于多种信号分子在组织之间进行的信息传递[1]。Sonichedgehog(Shh)是一类在胚胎发育过程中起关键作用的信号分子,转基因鼠实验发现,Shh无效突变(nullmutation)会导致底板、神经管、体节和肢体发育的严重障碍,造成死亡
3、[2]。牙胚是研究器官发生的良好模型。研究表明:Shh在牙胚发育早期上皮-间充质和上皮-上皮之间的信号传导中发挥重要作用,特别是调控上皮和间充质细胞的增殖,诱导早期牙形态发生[3]。牙胚发育晚期Shh是否参与了上皮-间充质之间的信号传递,作为一种信号分子启动成釉细胞、成牙本质细胞的分化过程尚未知。本研究旨在利用原位杂交技术检测牙胚发育晚期ShhmRNA的表达,构建晚期ShhmRNA时空表达模式,为进一步探讨Shh对细胞分化是否有作用及其机制奠定基础。1 材料和方法1.1 材料通过交配成年昆明小鼠(湖北省医
4、科院)获得不同胎龄的鼠胚胎。阴道栓出现的当日中午定为胚胎发育的第0.5天(E0.5)。拉颈处死孕鼠,分离胚胎第16.5天(E16.5)至出生后1.5d的动物下颌骨,立即置于新鲜配置的40g/L多聚甲醛内,4℃固定24h。100g/LEDTA脱矿48h。系列乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,5μm连续矢状切片,贴附于经20g/LAPES硅化和0.1g/LPLL包被的玻片上,4℃保存备用。实验中所有试剂均由含DEPC水配制,以消除RNA酶的作用。1.2 方法1.2.1 探针制备含有小鼠ShhcDNA的重组质粒p
5、BluescriptⅡSK由哈佛大学AndreL),湿盒中37℃下处理30min以去除组织中的mRNA,再滴加反义ShhcRNA探针。阴性探针对照采用正义ShhcRNA探针与切片杂交。超敏原位杂交及检测试剂盒购自美国MBI公司,生物素化抗地高辛抗体购自美国Sigma公司,基本步骤遵循试剂盒操作手册。BCIP/NBT显色,核伊红淡复染,AEC封片,光镜下观察。2 结果E16.5~P1.5牙胚发育经历了钟状早期、钟状晚期、基质分泌期。ShhmRNA阳性信号主要位于胞浆内,为紫蓝色颗粒。①钟状早期(E16.5)
6、:此期成釉器进入成熟期,其凹面的形状已被确定。成釉器上皮细胞进一步分化,除外釉上皮、星网状层、内釉上皮外,在内釉上皮和星网状层之间出现了1~3层扁平细胞,即中间层细胞。牙乳头被成釉器环绕。口腔上皮、内釉上皮层、外釉上皮层和中间层细胞中可见紫蓝色颗粒,前成牙本质细胞层及其内侧的牙乳头表达较弱或无表达(图1,见彩色插页)。星网状层、牙囊中未见ShhmRNA阳性信号。与正义探针杂交的对照片及阴性组织对照片在此期及以后各期均未见特异性杂交信号(图2、4、6,见彩色插页)。②钟状晚期(E18.5):主要牙尖区域的前
7、成牙本质细胞完成终末分化。内釉上皮细胞进一步分化为前成釉细胞,胞核远离基底膜。在此期,前成釉细胞和中间层细胞中均可见紫蓝色颗粒,牙尖、颈环处紫蓝色最深。成牙本质细胞层信号较弱(图3,见彩色插页)。③基质分泌期(P1.5):主要牙尖区域形成一层前期牙本质,前成釉细胞完成终末分化。ShhmRNA在主要牙间区域的成牙本质细胞呈阳性表达,成釉细胞和中间层细胞中的杂交信号较前期明显减弱(图5,见彩色插页)。3 讨论牙体组织的形成过程包括细胞分化、有机基质的分泌和矿物质的沉积。以上过程严格受到上皮-外胚间充质相互作用
8、的调节。研究表明:在细胞分化和基质分泌过程中,一系列基因产物表达于上皮-外胚间充质交界的相应细胞,构成了在硬组织形成中发挥关键作用的特定分子网络,直接或间接参与了细胞分化和生物矿化过程。本组设置的阴性组织对照和正义探针对照均无阳性杂交结果出现,表明反义ShhcRNA探针与组织中的ShhmRNA是特异性结合,灵敏度高。研究发现ShhmRNA在牙胚发育晚期的内釉上皮层和中间层始终有表达,这与Iseki[5]的研究结果一致。Shh的
