套式pcr检测唾液中变形链球菌及远缘链球菌差异

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1、套式PCR检测唾液中变形链球菌及远缘链球菌差异-->套式PCR检测唾液中变形链球菌及远缘链球菌差异【摘要】　目的探索一种快速、简便地从人类唾液中同时检测变形链球菌和远缘链球菌的方法。医学论文发表方法分别以变形链球菌gtfI和远缘链球菌gtfB基因设计两组成套引物,首先用套式PCR(二次PCR)检测变形链球菌和远缘链球菌标准株和临床株,然后用套式PCR直接从唾液中检测这两种细菌。结果　变链菌(血清型c,e,f)的标准株及临床株第1次PCR扩增产物为517bp,第2次扩增产物为468bp;远缘链球菌(血清型d,g)及道勒链球菌(血清型h)的标准株及临床株第1次PCR扩增产物为712bp,第2次扩

2、增产物为663bp;其他异种菌均不能扩增出产物,因此该PCR检测具有高度的特异性。细菌纯培养物及唾液PCR检测的敏感性分别是:第1次PCR为105CFU,第2次PCR为103CFU。结论　套式PCR能快速在人类唾液中同时检测变形链球菌和远缘链球菌。该检测方法有望运用于临床检测,对揭示两种细菌与龋病发生关系的研究具有一定价值。【关键词】　聚合酶链反应;　唾液;　链球菌,变异以往研究表明,在变形链球菌群中变形链球菌(S·mutans,简称变链菌,血清型c,e,f)为人类的最主要致龋菌,检出率最高;而远缘链球菌(S·sobrinus,血清型d,g)检出率较低,甚至在某些个体中只能检出变链菌[1,2

3、]。但近来有报道,常规轻唾-杆菌肽琼脂(MSBA)培养可能抑制远缘链球菌的生长,影响其检出率;与变链菌相比,远缘链球菌可能具有更强的致龋潜力,对龋病的发生和活跃性可能更为重要[3,4]。也有学者持不同意见[5]。因此,鉴定变链菌和远缘链球菌,研究人类口腔中这两种细菌检出率的差异,对探索两种细菌与龋病关系非常重要。以往区分和鉴定变形链球菌和远缘链球菌的方法(如观察菌落形态、生化鉴定、免疫血清学鉴定、DNA探针等)费时且灵敏度不高。聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)在检验致病菌方面具有简便、省时、敏感等优点[6,7]。其中,套式PCR可明显提高PCR检测的特异

4、性和敏感性[8]。研究表明唾液中致龋微生物水平与牙菌斑中的水平呈正相关,且唾液样本适合于致龋微生物的定量检测[9]。我们运用套式PCR技术,检测人类唾液中变形链球菌和远缘链球菌,旨在探求一种适合临床应用、快速敏感的致龋微生物检测方法。材料与方法一、主要试剂1·引物:分别以变形链球菌gtfI和远缘链球菌gtfB基因设计两组成套寡核苷酸引物。由GIBCOBRL公司合成(表1)。　　2·试剂:溶菌酶液,蛋白酶K液,苯酚、氯仿(1∶1),PCR试剂(Taq酶,4种dNTP混合物等)。二、细菌标准株细菌均系武汉大学口腔医学院中心实验室收藏保存菌株。所使用的变链菌属(血清型a~h)为:仓鼠链球菌(S·c

5、ricetus)AHT(血清型a),鼠链球菌(S·rattus)BHT(血清型b);变链菌(S·mutans,血清型c)Ingbritt,GS-5,Kpsp2,ATCC10449,UA96,UA159;变链菌(血清型e)LM7,MT703;变链菌(血清型f)OMZ175,MT6219;远缘链球菌(S·sobrinus,血清型d)OMZ176,B13;远缘链球菌(S·sobrinus,血清型g)OMZ65,6715;道勒链球菌(S·doitis)ATCC9811;血链球菌(S·sanguis)903;格登链球菌(S·gordonii)V288;粘性放线菌(A·vicosus)ATCC19246

6、,ATCC29525;大肠杆菌(E·coli)JM109,DH5α;牙龈卟啉菌(P·gingivalis)ATCC33277;假单胞菌(Pseudomonas)AB93065,AB93077,AB90024,AB90056,AB90057,AB94179。二、方法1·研究对象:选择武汉大学口腔医学院研究生10名,编号为A~J。2·唾液样本收集:据Hirose等[3]方法,于餐后2h采用吐唾法收集无刺激全唾液,一式两份。3·分离、纯化、鉴定变链菌和远缘链球菌临床菌株:将所收集唾液分别于振荡器上充分混匀,并在磷酸钠缓冲液中系列稀释后取100μl稀释菌液分别涂布于MSBA平皿。于厌氧罐中,37℃、

7、95%N2、5%CO2培养48h。观察细菌生长情况,根据体现显微镜下典型菌落形态初次鉴定变形链球菌和远缘链球菌。将典型菌落作次代培养,获得纯培养后作生化鉴定(精氨酸、七叶苷水解、山梨醇、甘露醇、密二糖、棉子糖发酵)。4·细菌染色体DNA的提取:1ml细菌隔夜培养物,8000r/mim离心,4℃10min,去上清,200μlTE缓冲液冲洗2次,将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中,37℃,1h,加4