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时间:2018-10-29
《大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞mtorp70s6k表达》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞mTORP70S6K表达:朱政孙守刚许广莉王琼英白锋【摘要】目的探讨姜黄素对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖体蛋白质S6激酶(P70S6K)在血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法54只雄性SD大鼠随机分为对照组、损伤组和药物干预组。颈动脉HE染色和组织病理图像分析;免疫组织化学观察PA与P70S6K组织表达中的病理变化;实时定量PCR检测mTORP70S6K及PA的mRNA表达;ELISA测定血清白介素18(IL18)水平变化。结果实验术中死亡大鼠1只,取材过程中发现动脉闭塞5只(分
2、别为3d药物干预组和7d损伤组各1只,14和28d药物干预组各2只)。HE染色显示14d药物干预组与损伤组相比内膜与中膜增殖厚度明显减低,组织图像分析三组之间内膜厚度差异无统计学意义,而中膜厚度差异具有统计学差异(P=0.000);免疫组化结果示对照组与损伤组及药物干预组存在差异(P=0.045);实时荧光定量PCRmTORP70S6K及PA的mRNA损伤组与对照组相比具有统计学意义(P<0.05);ELISA示与对照组相比姜黄素能抑制第3、7、14天药物干预组血清IL18浓度,具有统计学意义(P均<
3、0.05)。结论姜黄素能够抑制IL18、mTORP70S6k及PA在损伤血管平滑肌细胞中的表达,并能抑制平滑肌细胞增殖,可能成为预防再狭窄的新药物。【关键词】姜黄素;血管平滑肌细胞;白介素18;雷帕霉素靶蛋白;核糖体蛋白质S6激酶 近年来,心血管病特别是冠心病的高发病率、高致残率和高死亡率给社会及居民造成沉重负担。经皮冠脉介入(PCI)已成为治疗冠心病的最有效手段之一,但是其长期获益受到了血管再狭窄的限制,Odell和Garg等〔1,2〕研究表明,支架植入术后9个月再狭窄率为5%~8%以上。药物涂层支架使再狭窄
4、率明显下降,但晚期支架内血栓引起了人们的关注〔3〕。尽管临床上给予PCI术后双联甚至三联抗血小板药物,但再狭窄仍是支架置入术后预防的重点和难点。球囊机械损伤,冠脉再狭窄的主要原因是由于血管平滑肌细胞(VSCM)的异常增殖、迁移和纤维化。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种主要成分,其通过下调P13K/Akt通路抑制VSMC增殖与迁移。姜黄素已用于生物可吸收支架,对PCI术后再狭窄及支架内血栓起到抗增殖及预防作用〔4〕。目前国内对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白质S6激酶(P70S6K)与白介素18(IL18)和再
5、狭窄关系研究未见相关文献报道。本实验在于讨论姜黄素是否能够通过降低mTORP70S6K及IL18的表达,从而降低PCI术后再狭窄的发生。 1材料与方法 1.1主要药物及试剂98%高效液相色谱姜黄素购于陕西森弗生物技术公司;IL18ELISA试剂盒及RNA纯化试剂Trizol分别购于美国ADL公司与Invitrogen公司;RTPCR反转录试剂盒和PCR试剂盒购于日本Toyobo公司;PA和P70S6K抗体购于美国Biog/kg腹腔麻醉后,尾静脉给予肝素100U/kg。颈前正中切开皮肤及皮下组织,动脉夹分别
6、夹住颈总动脉和颈内动脉,在颈外动脉剪一楔形切口,插入2F(2×20mm)球囊(Medtronic,美国),注入生理盐水0.2ml使其膨胀,缓慢回拉球囊至平切口处,抽出球囊内液体,重复上述过程三次,退出球囊,结扎颈外动脉,恢复血流。庆大霉素40万U冲洗切口后缝合皮下组织及皮肤。青霉素40万U/d肌肉注射,连续3d。普通饲料喂养,自由饮水。对照组仅切开皮肤分离皮下组织,不插入球囊,药物干预组给予姜黄素100mg·kg-1·d-1灌胃。取材:所有动物分别在第3,7,14和28天麻醉后取全血及左侧颈总动脉后脱臼处死。全血40
7、00r/min离心20min取上清-20℃冰箱保存;颈总动脉经肝素生理盐水冲洗后分两等份,40g/L甲醛固定和液氮保存。 1.2.2IL18检测ELISA按试剂盒操作说明进行操作。 1.2.3组织病理(HE)及图像分析及免疫组织化学将病理标本在40g/L中性甲醛液中固定24h后,逐级乙醇脱水,石蜡包埋,间断均匀切片(片厚5μm)。对病理切片行免疫组化染色,观察受损血管组织形态学改变、同时采用计算机全自动图像分析系统测定受损血管内膜与中膜厚度。 1.2.4实时定量PCR 1.2.4.1引物设计与合成根据Gen
8、bank提供的基因序列及引物设计原则应用PrimerPremier5和Oligo6引物设计软件,自行设计引物,由北京三博远志公司合成。mTOR正链5′GAATCAGACAGGCACGAAGG3′,反链5′TCTTCTTCCAGCAAGTTCAGC3′;P70S6K正链5′AAAGAAGAGGAAGCTGT3′,反链5′CTTTAA
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