注射用替加环素的被动皮肤过敏性的原因分析

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1、注射用替加环素的被动皮肤过敏性的原因分析替加环素是全球首个被批准的用于静脉注射的甘氨酰环素类抗生素[1，2]，其结构与四环素类药物相似。替加环素抗菌谱广，对有耐药性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也有活性，2005年6月美国FDA批准该药应用于成人复杂皮肤及软组织感染和成人复杂的腹内感染，包括阑尾炎、烧伤感染、腹内脓肿、深部软组织感染及溃疡感染。为了分析注射用替加环素的过敏性，我们采用了大鼠皮肤被动过敏试验（PCA）进行评价。1仪器与材料1.1仪器BS600L电子天平（上海友声衡器有限公司）；FA1004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；722S可见分光

2、光度计（上海梭光技术有限公司）；TDL-80-2B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2试药0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号：M11120411，规格：500ml）；卵白蛋白（美国Sigma公司，批号：A-5252，规格：10g）；注射用替加环素（四川中兴药物有限公司，批号：20111201，规格：50mg）。伊文思蓝（UNI-CHEM，批号：GD4061465）；丙酮（成都市科龙化工试剂厂，批号：20080303，规格：500ml）；弗氏完全佐剂（sigma，批号：F5881，规格：10ml）；弗氏不完全佐剂（sigma，批号：

3、F5506，规格：10ml）。1.3动物大鼠32只，体重180～220g，雌性12只，雄性20只，均购于四川省实验动物专委会养殖场，生产许可证号：SCXK（川）2008-14。2方法2.1溶液的制备1）抗血清药物溶液的制备[3-5]：用0.9%氯化钠注射液配制成浓度10mg/ml的卵白蛋白阳性对照组溶液和1.5mg/ml、0.5mg/ml的替加环素高、低剂量组溶液。2）致敏溶液的制备：分别取4组抗血清，用0.9%氯化钠注射液稀释成1∶2、1∶4、1∶8的溶液。3）激发溶液的制备：用0.5%伊文思蓝-0.9%氯化钠注射液配制成浓度1mg/ml的卵白蛋白阳

4、性对照组溶液和1.5mg/ml、0.5mg/ml的替加环素高、低剂量组溶液。2.2分组和给药方法1）抗血清制备分组：8只雄性大鼠分别按体重分为阴性对照组（氯化钠注射液）、阳性对照组（卵白蛋白）和替加环素高、低剂量组，每组2只。2）致敏和激发试验分组：取大鼠24只，雌雄各半，按体重分为阴性对照组、阳性对照组和替加环素高、低剂量组，每组6只。3）抗血清制备方法：阴性对照组（0.9%氯化钠注射液）、阳性对照组（10mg/ml卵白蛋白）、替加环素高剂量组（1.5mg/ml）、替加环素低剂量组（0.5mg/ml）4组大鼠分别腹腔注射相应药物1ml/只，同时腹腔注

5、射弗氏（完全/不完全）佐剂0.2ml/只（首次注射使用弗氏完全佐剂，后两次注射使用弗氏不完全佐剂），隔日注射1次，共3次。末次注射后14d，大鼠股动脉取血，分别收集4组的血液置于室温下，析出血清，离心（3000r/min，15min）。在无菌条件下，吸出抗血清，各组抗血清分别混匀，-20℃冷冻保存。4）致敏方法：致敏前将每只大鼠背部从头部沿尾部方向划分为3个区域，并用记号笔画一个直径为2cm的圈作为标记，靠近头部的区域为1∶2稀释度区，中间的区域为1∶4稀释度区，靠近尾部的区域为1∶8稀释度区。各组分别于圈内皮内注射相应稀释度的抗血清0.1ml。激发方

6、法：致敏24h后，阴性对照组（0.9%氯化钠注射液）、阳性对照组（1mg/ml卵白蛋白）、替加环素高剂量组（1.5mg/ml）、替加环素低剂量组（0.5mg/ml）4组大鼠，分别尾静脉注射已加入伊文思蓝的相应药物1ml/只进行激发。2.3观察指标激发30min后断头处死大鼠，剪取背部皮肤，分别测量皮肤内层3个区域的蓝斑大小，直径大于5mm者判为阳性，不规则斑点的直径为长径与短径之和的1/2。将各蓝色斑皮片剪下，剪碎，分别加入丙酮-0.9%氯化钠注射液（7∶3）混合液5ml，浸泡48h，离心（2000r/min，20min），取上清液测吸光度（波长610

7、nm）。2.4数据处理采用Fisher精确检验法统计，计量资料采用t检验统计。P0.05表示具有显著性差异。3结果大鼠背部皮肤3个区域（1∶2稀释度，1∶4稀释度，1∶8稀释度）的蓝斑观察结果见表1。阳性对照各稀释组大鼠蓝斑直径均为阳性（P0.001）。注射用替加环素高、低剂量各稀释组蓝斑直径均为阴性（P0.001）。注射用替加环素对大鼠未产生被动皮肤过敏反应。4讨论按照仿制药的注册申报要求，注射剂应进行临床前的过敏性评价研究。药物的过敏反应中，发生率最高的为Ⅰ型变态反应。豚鼠体内补体非常丰富，能最直观地反映Ⅰ型变态反应，因此豚鼠全身主动过敏试验常用于

8、过敏性实验的评价研究。但是豚鼠对抗生素的敏感性比小鼠高1000倍，对青霉素类、红霉素类、四环素