丙型肝炎病毒1b型5＇端5223 bp半基因组扩增

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1、丙型肝炎病毒1b型5＇端5223bp半基因组扩增王小红，熊瑜琳，李俊刚，谭朝霞，胡亚君【关键词】丙型肝炎病毒Amplificationof5＇terminal5223bpfragmentofhepatitisCvirusgenotype1b　　【Abstract】AIM:Toamplify5＇terminal5223bpfragmentofhepatitisCvirus(HCV)genotype1b.METHODS:FivehumanserumspecimensinfectedHCVRNApositiverepository.TotalRNAetho

2、dsincludingTRIzolLSReagent,QIAampviralRNAminikitandMagicbead.TheextractedRNAizationforlongPCRamplificationedbyparingdifferentTaqenzymesandcyclesystems.The5＇halfoftheHCV1bgenomeplifiedplatesoleculesadeinfolloinand48℃for2minandthen75℃for10min.LongPCRamplificationofHCVfragmentTaqD

3、NApolymeraseHighFidelityasinat94℃folloinat72℃,or5cyclesof15sat94℃,and5minat68℃folloinentof10spercycleat68℃andfinally14.5minat72℃.BothcyclingconditionsplificationefficiencyofTaKaLaLATaqTMissuperiortoPlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelityunderthisreactioncondition.5223bpHCVfragment

4、all5specimensbyutilizingtheoptimizedRTPCRprotocolandtheirgenotypesedbysequenceanalysis.CONCLUSION:The5＇terminal5223bpfragmentofHCVigenome　　【摘要】目的：扩增丙型肝炎病毒(HCV)1b型5＇端5223bp半基因组.方法：取5份HCV1b血清标本，采用3种RNA提取方法，比较几种逆转录酶及逆转录条件，选取不同Taq酶进行长链RTNestedPCR反应体系及循环条件的筛选和优化，利用最佳的模板提取方法及优化的RTPCR

5、反应条件扩增出5＇端长度为5223bp(5223bp)半基因组.结果：Trizol法可以获得完整的RNA模板，适合长链的扩增；应用ReverTraAceaTM酶和SuperScriptTMⅡ，反应条件为42℃10min后，42℃2min,48℃2min，30个循环，然后75℃,10min；可获得完整的cDNA模板；TaKaLaLATaqTM和PlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelity采用两种扩增条件：①94℃变性2min,94℃30s，62℃30s，72℃4.5min,扩增30个循环；②94℃变性2min，94℃15s，

6、68℃5min，扩增5个循环，然后94℃15s，68℃5min(每个循环延长10s)，扩增20个循环,最后72℃延伸10min，均可获得HCV1b型5＇端5223bp半基因组的阳性结果，TaKaLaLATaqTM扩增效果最好；PCR产物经核苷酸序列测定证实为HCV1b型.结论：通过各种条件的优化，成功地实现了5＇端半基因组的扩增，为下一步全长质粒及复制子的构建打下了基础.　　【关键词】丙型肝炎病毒；长链RTPCR；半基因组　　0引言　　丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)基因组是一单股正链RNA，全长大约由9600核苷酸组成，是引起

7、丙型肝炎的病原体.HCV基因组具有明显的异质性，根据其核苷酸序列的差异，分为6个主要的基因型，50多个亚型及不同的HCV分离株〔1〕.同时，HCV以一群不同的但密切相关的变异株存在于患者体内，称为准种（quasispecies）.传统的HCV全基因组质粒的构建通常采用短片段拼接而成〔2〕，国内有报道采用4个片段扩增构建全长质粒〔3〕，最近国外文献报道的全长基因组质粒的构建也多是采用3个片段拼接而成〔4〕.这种短片段的拼接很容易造成准种间的不同变异株的不真实连接，使所构建的HCV全基因组并不是实际存在的基因，限制了HCV分子水平的研究.长链扩增可以最大

8、限度地避免这种准种间不真实连接，使所构建的HCV全基因组质粒更为真实可靠.我们选取中国HCV主要流行株1b型