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时间:2018-10-28
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1、丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化韩振格,乔伟振,张敏,孙艳雯,董晨,孟继鸿【摘要】目的:表达和纯化丙型肝炎病毒(HCV)Core、NS3和NS4的His融合抗原HC、HNS3和HNS4,并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法:用重组基因工程技术,构建3种重组质粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)和NS4pET28ac(+)以及相应的工程菌;质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后,IPTG诱导抗原表达,从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件;用NTA柱纯化抗原后,分别用单片段重组抗原和混合抗
2、原以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果:用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中,HC、HNS3和HNS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%,而HC、HNS3和HNS4混合抗原的抗体检出率为100%;检测40份健康人血清,结果全部为阴性。结论:HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率,但均低于混合抗原的阳性率;在开发HCV抗体诊断试剂时,应采用HCV混合抗原。【关键词】丙型肝炎病毒;His融合抗原;抗原纯化;表达常用的HCV感染诊断方法主要是用ELISA检测抗
3、HCV。目前,国内外HCV抗体检测试剂均已开发了3代产品,其包被抗原大多采用基因工程抗原〔12〕,主要包括HCVCore、NS3和NS4。虽然现在普遍应用的第3代ELISA检测试剂的质量较前两代有了很大提高〔3〕,但仍存在一定程度的假阳性和漏检〔48〕,如何提高HCV抗体ELISA检测试剂的质量是一个亟待解决的问题。而探索和开发更好的HCV抗原,是完善抗体检测试剂盒的关键。我们在以往研究HCV重组抗原〔910〕的基础上,应用基因工程的方法,表达和纯化HCVHis融合抗原HC、HNS3和HNS4,用血清学方法对其抗原性进行了初步鉴定,为进一步研制高
4、质量的HCV抗体检测试剂奠定基础。1材料和方法1.1重组质粒的构建与鉴定以3种重组质粒CpGEX4T2、NS3pGEX4T2和NS4pGEX4T2(美国CDC惠赠)为模板,分别用PCR方法扩增HCV结构与非结构区基因Core、NS3和NS4。PCR扩增条件:94℃预变性2min;然后92℃变性45s,54℃退火45s,72℃延伸1min30s,共35个循环;最后一个循环结束后延伸8min。PCR产物用3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit(上海申能博彩生物科技有限公司)回收。质粒载体pET28ac(+)和PCR
5、产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ酶切;将酶切后的3种PCR产物分别与酶切后的质粒载体pET28ac(+)连接;取5μl连接产物转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞,取100μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素(K+)的LB培养基平板,涂匀后置37℃培养过夜。挑取能在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基,37℃震荡培养过夜。用PlusMiniprepsDNAPurificationSystems(Promega)抽提质粒。重组质粒经PCR、双酶切、测序进行鉴定。1.2His融合抗原的诱导表达将鉴定正确的重组质粒[CpET28ac(+)、NS3pE
6、T28ac(+)、NS4pET28ac(+)]分别转化大肠杆菌BL21感受态细菌。取100μl菌液涂布于K+LB培养基平板,涂匀后置37℃培养过夜。挑取在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基,37℃震荡培养过夜,次日转1ml过夜培养菌液至100mlK+LB液体培养基,37℃摇床继续培养至OD600nm=0.6,平均分入5支已高压灭菌的50ml大试管,再加入IPTG(Sigma)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8及1.0mmol·L-1,37℃继续培养1h,收集细菌沉淀,SDS/PAGE确定抗原表达量较高时所需较低的IPTG浓度(即
7、适宜诱导剂浓度);用此浓度IPTG,分别在25、28、30、35及37℃诱导抗原表达的收集细菌沉淀,SDS/PAGE确定抗原表达量较高时的适宜诱导温度;用适宜IPTG浓度,在适宜的诱导温度下诱导抗原表达0.5、1、1.5、2及3h,收集细菌沉淀,超声裂解细菌,4℃10000r·min-1离心15min,分别收集细菌裂解上清和沉淀,SDS/PAGE确定适宜诱导表达时间,了解抗原的表达方式(可溶性/包涵体),初步制定抗原纯化方案。1.3His融合抗原纯化在优化的表达条件下扩大细菌培养,诱导抗原表达,收集细菌沉淀。用50mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)缓
8、冲液(含有1mg·ml-
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