il1β诱导大鼠肝细胞no产生增多线粒体膜电位降低

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1、IL1β诱导大鼠肝细胞NO产生增多线粒体膜电位降低【摘要】目的：观察体外培养的大鼠肝细胞在促炎细胞因子IL1β刺激下一氧化氮(NO)的产生和线粒体膜电位的变化，探讨两者之间的关系。方法：原位胶原酶灌注法分离和培养原代大鼠肝细胞后，分别用生理盐水、脂多糖(LPS)(10mg·L-1)、IL1β(1nmol·L-1)及LPS(10mg·L-1)联合IL1β(1nmol·L-1)刺激肝细胞，并分别在刺激后6、12、24、48h留取细胞和上清液，采用分光光度法测定上清液NO的含量，采用荧光探针JC1结合流式细胞仪检测肝细胞线粒

2、体膜电位的变化。结果：IL1β刺激后肝细胞产生NO增加而线粒体膜电位降低，两者均呈时间依赖性，并在24h达峰值;LPS对肝细胞NO的合成没有直接诱导作用，与IL1β联合刺激也没有协同作用。结论：IL1β诱导肝细胞过度产生NO从而抑制线粒体呼吸功能可能是炎症应激下肝损伤的潜在机制之一。【关键词】肝细胞;线粒体;白细胞介素1β;一氧化氮;膜电位;大鼠肝功能障碍是脓毒症患者常见的临床表现，也是导致脓毒症患者并发多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)及死亡的重要原因[1]

3、。近年来发现，线粒体功能障碍导致的机体能量代谢异常可能在脓毒症向MODS的发生和发展过程中发挥了关键的作用[25]，脓毒症时肝脏产生大量NO抑制线粒体呼吸功能可能是其潜在的损伤机制[67]。IL1β是脓毒症早期炎症反应过程中释放的一种促炎细胞因子，在体外能够诱导肝细胞NO合酶(iNOS)基因的表达，促进NO的产生[78]。以往的实验多通过ATP浓度或线粒体酶复合物活性来间接反映线粒体的功能[4，67]，本研究旨在体外观察IL1β对大鼠肝细胞NO产生的影响，通过肝细胞线粒体膜电位的变化，从总体水平反映线粒体的功能，并探

4、讨两者间的关系。　　1材料与方法　　1.1实验材料　　内毒素大肠杆菌O111:B4型(Sigma公司，美国)，重组大鼠IL1β(PeproTech公司，美国)，RPMI1640培养基(GIBCO公司，爱尔兰)，小牛血清(民海生物工程有限公司，中国兰州)，Ⅳ型胶原酶(Invitrogen公司，美国)，DNaseⅠ(Sigma公司，美国)，6孔培养板(Griner公司，美国)，NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)，JC1荧光探针(MolecularProbe公司，美国)。　　1.2肝细胞的分离和培养　　肝细胞分离采

5、用本实验室改良的原位两步灌注法[9]：选取6周龄雄性SD大鼠(180～220g)，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后，腹部备皮碘伏消毒，作5～6cm的腹正中切口，用7号头皮针管行门静脉及下腔静脉腹腔段置管，建立肝脏灌注回路，结扎下腔静脉胸腔段，第1步用含0.5mmol·L-1EDTA的DHanks液以20～40ml·min-1的速度灌注5～10min，去除肝脏血液，当下腔静脉流出液体变清后，第2步用含有Ⅳ型胶原酶的消化液进行循环灌注消化，消化液配方为100mlHanks液+50mgⅣ型胶原酶+8mgDNaseⅠ,当肝脏变软、肝包膜出

6、现皱缩破裂说明消化充分，取出肝脏剪成碎块置入RPMI1640培养基中，260目金属滤网过滤后，低速离心(50×g共5min)，反复洗涤3次可获得高纯度的原代肝细胞。通常可获得肝细胞总量为(1～2)×108个，细胞活力大于50%，纯度高于90%。将获取的肝细胞以1×106ml-1的浓度种植于6孔培养板中，每孔加入2ml细胞培养液，细胞培养液配方为RPMI1640培养基+100U·L-1青霉素+100μg·L-1链霉素+0.3mg·ml-1L型谷氨酰胺+0.16U·ml-1胰岛素+10%小牛血清。　　1.3实验分组　　肝细胞在5%C

7、O2的37℃培养箱培养48h后换新鲜培养液，换液后单孔细胞数量约为1×106个，选8块6孔培养板共48孔细胞，分成4组，每组12孔，分别用生理盐水(NS)、血清脂肪酶(LPS)(10mg·L-1)、IL1β(1nmol·L-1)和LPS(10mg·L-1)加IL1β(1nmol·L-1)处理，并分别在处理后6、12、24和48h留取细胞检测线粒体膜电位，同时检测细胞上清液NO含量。　　1.4NO的检测　　利用NO遇氧和水生成硝酸盐和亚硝酸盐的原理，通过反应体系将样本中的NO转化为硝酸盐，再采用分光光度法(DU800型分光光度

8、计，美国Beckman公司)测定硝酸盐的含量，可间接测知NO的浓度，具体参照NO检测试剂盒说明书进行操作。　　1.5肝细胞存活率及线粒体膜电位的检测　　将取下的肝细胞用PBS重悬，取一小滴于计数板上采用台盼蓝拒染法计算肝细胞存活率，其余2000r·min-1离心