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1、IL23、IL17在桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达:吴汉妮,余玲,屈新才,钱伟,肖波【摘要】 目的:检测桥本甲状腺炎(HT)甲状腺组织中白细胞介素(IL)23、IL17的表达,并探讨IL23/IL17在HT免疫病理中的作用。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和RNA和蛋白的表达水平。结果:RTPCR显示IL23p19、IL17mRNA在HT甲状腺组织中的平均表达水平分别为1.0154±0.5749、0.5952±0.2513,正常对照组的表达水平分别为0.0929±0.0242、0.1537±0.0855;两组比较,HT患者甲状腺组织IL
2、23p19、IL17mRNA的表达水平显著高于正常对照(P<0.05);且在HT中,IL23p19和IL17mRNA的表达存在正相关(P<0.01,r=0.861)。otothyroiditis,HT)是器官特异性自身免疫性疾病,确切的发病机制仍未清楚。目前较为一致的观点认为,在遗传素质与环境因素相互影响的基础上,机体免疫系统紊乱是导致HT发病的主要原因。传统理论认为,自身反应性T细胞在HT的免疫机制中起关键作用。近期研究发现,机体存在一种新的CD4+T细胞亚型Th17,产生IL17具有IL23依赖性[1-3]。相关研究表明,IL23/IL17与自身免
3、疫病关系密切[4-6]。本研究拟通过检测HT患者甲状腺组织中IL23p19和IL17的表达水平,探讨IL23/IL17在HT发病中的作用。 1对象和方法 1.1研究对象2006-03/2007-06在华中科技大学同济医学院甲状腺手术的HT患者甲状腺样本20例(其中男6例,女14例),年龄37~54岁,平均(44.17±9.33)岁,均因甲状腺肿出现气管压迫症状或疑诊为甲状腺癌施行手术,术后病理证实为桥本甲状腺炎。15例甲状腺腺瘤旁的“正常”甲状腺组织作为对照(其中男5例,女10例),年龄35~56岁,平均(45.33±9.41)岁,经病理证实无肿瘤细胞的浸润。 1
4、.2方法 1.2.1逆转录聚合酶链反应(RTPCR)根据GenBank人IL23p19、IL17的cDNA序列设计引物,以GAPDH作为内参照。引物序列由上海英俊公司合成:IL23p19:5′ACAACTGAGGGAACCAAACCA3′,5′CAGCAGCAACAGCAGCATTAC3′;IL17:5′GGCTGGAGAAGATACTGGTGT3′,5′TTTAGTCCGAAATGTAGGCTGT3′;GAPDH:5′AGTCAGCCGCATCTTCTTTT3′,5′GAGTCCTTCCACGATACCAA3′。取甲状腺组织,用TRIzol(
5、Invitrogen公司)提取总RNA,并逆转录为cDNA(Promega公司)。通过预实验确定各项检测指标的PCR反应条件和最适循环数,以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。IL23p19、IL17的PCR反应条件:94℃5min,1循环;94℃45s,54℃45s,72℃45s,35循环;72℃7min,1循环;产物长度均为172bp。GAPDH:94℃5min,1循环;94℃45s,53℃45s,72℃45s,35循环;72℃7min,1循环;产物长度575bp。取4μLPCR产物电泳,SensiAnsys凝胶图像分析系统分析电泳条带的光密度值,用相对光密度值
6、代表mRNA的表达量。相对光密度值=(IL23p19或IL17光密度值/GAPDH光密度值)×100%。 1.2.2L/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液(三氨基甲烷缓冲盐溶液)封闭1h,再加兔抗人IL17多克隆抗体(PEPROTECH公司),4℃过夜。含2mL/LTageProPlus5.0图像分析软件分析条带的光密度值,用相对光密度值代表蛋白的表达量,相对光密度值=(IL23p19或IL17光密度值/βactin的光密度值)×100%。 1.2.3统计学分析采用SPSS10.0软件进行统计学分析。所有数据用x±s表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,显著性水准
7、P<0.05。相关分析采用Spearman秩相关分析法分析,以P<0.01为差异有统计学意义。 2结果 2.1甲状腺组织中IL23p19、IL17表达水平与对照组相比,HT组IL23p19、IL17mRNA和蛋白的平均表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,表1)。RTPCR电泳图中可见,对照组和HT组在172bp处都有IL23p19和IL17条带出现,但在HT组的表达强度明显高于对照组(图1)。RNA和蛋白在两组甲状腺组织的平均表达水平(略)