il23、 il17在桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达

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1、IL23、IL17在桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达作者：吴汉妮,余玲,屈新才,钱伟,肖波【摘要】　　目的:检测桥本甲状腺炎（HT）甲状腺组织中白细胞介素（IL）23、IL17的表达,并探讨IL23/IL17在HT免疫病理中的作用。方法:采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和Westernblot方法,检测20例HT患者和15例正常甲状腺组织中IL23p19、IL17mRNA和蛋白的表达水平。结果:RTPCR显示IL23p19、IL17mRNA在HT甲状腺组织中的平均表达水平分别为1.0154±0.5749、0.595

2、2±0.2513,正常对照组的表达水平分别为0.0929±0.0242、0.1537±0.0855;两组比较,HT患者甲状腺组织IL23p19、IL17mRNA的表达水平显著高于正常对照（P<0.05）;且在HT中,IL23p19和IL17mRNA的表达存在正相关（P<0.01,r=0.861）。Westernblot检测显示IL23p19、IL17蛋白在HT甲状腺组织中的平均表达水平明显高于正常对照（P<0.05）。结论:IL23、IL17在HT患者甲状腺组织中的协同过表达,提示IL23/IL17可能参与了H

3、T的免疫病理过程。【关键词】桥本甲状腺炎;白细胞介素23;白细胞介素17　　桥本甲状腺炎（hashimotothyroiditis,10HT）是器官特异性自身免疫性疾病,确切的发病机制仍未清楚。目前较为一致的观点认为,在遗传素质与环境因素相互影响的基础上,机体免疫系统紊乱是导致HT发病的主要原因。传统理论认为,自身反应性T细胞在HT的免疫机制中起关键作用。近期研究发现,机体存在一种新的CD4+T细胞亚型Th17,产生IL17具有IL23依赖性［1-3］。相关研究表明,IL23/IL17与自身免疫病关系密切［4-6］。本研究拟通过检测HT

4、患者甲状腺组织中IL23p19和IL17的表达水平,探讨IL23/IL17在HT发病中的作用。　　1对象和方法　　1.1研究对象2006-03/2007-06在华中科技大学同济医学院甲状腺手术的HT患者甲状腺样本20例（其中男6例,女14例）,年龄37～54岁,平均（44.17±9.33）岁,均因甲状腺肿出现气管压迫症状或疑诊为甲状腺癌施行手术,术后病理证实为桥本甲状腺炎。15例甲状腺腺瘤旁的“正常”甲状腺组织作为对照（其中男5例,女10例）,年龄35～56岁,平均（45.33±9.41）岁,经病理证实无肿瘤细胞的浸润。　　1.2方法　　1

5、.2.1逆转录聚合酶链反应（RTPCR）10根据GenBank人IL23p19、IL17的cDNA序列设计引物,以GAPDH作为内参照。引物序列由上海英俊公司合成:IL23p19:5′ACAACTGAGGGAACCAAACCA3′,5′CAGCAGCAACAGCAGCATTAC3′;IL17:5′GGCTGGAGAAGATACTGGTGT3′,5′TTTAGTCCGAAATGTAGGCTGT3′;GAPDH:5′AGTCAGCCGCATCTTCTTTT3′,5′GAGTCCTTCCACGATACCAA3′。取甲状腺组

6、织,用TRIzol（Invitrogen公司）提取总RNA,并逆转录为cDNA（Promega公司）。通过预实验确定各项检测指标的PCR反应条件和最适循环数,以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。IL23p19、IL17的PCR反应条件:94℃5min,1循环;94℃45s,54℃45s,72℃45s,35循环;72℃7min,1循环;产物长度均为172bp。GAPDH:94℃5min,1循环;94℃45s,53℃45s,72℃45s,35循环;72℃7min,1循环;产物长度575bp。取4μLPCR产物电泳,SensiAnsys凝胶

7、图像分析系统分析电泳条带的光密度值,用相对光密度值代表mRNA的表达量。相对光密度值=（IL23p19或IL17光密度值/GAPDH光密度值）×100%。　　1.2.2Westernblot检测取甲状腺组织标本,单去污裂解液提取组织蛋白,考马斯亮蓝法测蛋白浓度。每例标本取50μg蛋白样品进行SDSPAGE电泳,转膜,然后用含30mL/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液（三氨基甲烷缓冲盐溶液）封闭1h,再加兔抗人IL17多克隆抗体（PEPROTECH公司）,4℃过夜。含2mL/L10Tween的TBS缓冲液洗膜3次,加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗

8、（深圳晶美公司）,37℃孵育1h。洗膜3次,ECL显色,暗室显影。同法检测IL23p19蛋白表达,所用试剂:一抗为鼠抗人