hplc法测定羟基喜树碱在肾组织中的分布

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1、HPLC法测定羟基喜树碱在肾组织中的分布【关键词】高效液相色谱法；小鼠；肾脏；10-羟基喜树碱；组织分布喜树碱（Camptothecin，CPT）是从我国珙桐科植物喜树（CamptothecaacuminataDee）中提取得到的一类天然生物碱[1]，具有显著的广谱抗肿瘤活性[2]。10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是喜树碱的天然衍生物，是我国临床应用的喜树碱类抗肿瘤药物。目前已经有文献[3～8]报道检测血浆中HCPT含量的高效液相色谱法，但一般采用紫外检测器及使用外标法定量，灵敏度和准确度较低。本研究采用荧光检测器，以CPT

2、为内标，乙醚为萃取溶剂制备样品，建立了一种选择性好、灵敏度高的测定小鼠肾组织中HCPT浓度的高效液相色谱法，并将其应用于HCPT的肾组织中药动学研究。1仪器与材料1.1仪器:高效液相色谱系统，包括1525型二元泵、717型自动进样器、2475型荧光检测器（美国icro17型离心机（美国Thermo公司）；H-H-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；m×4.6mm，5μm）；流速：1.2mL·min-1；荧光检测器检测；激发波长：383nm；发射波长：553nm；流动相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，详细梯度洗脱条件见表1。**2.2溶液的制备:精

3、密称取HCPT或CPT各1mg，用甲醇溶解，定容至25mL，分别得浓度为40μg·mL-1贮备液，分装，－80℃冰箱保存备用。试验时，用甲醇将HCPT贮备液稀释成浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80ng·mL-1的系列标准溶液；用甲醇将CPT贮备液稀释成浓度为200ng·mL-1的溶液作为内标溶液，－80℃冰箱保存备用。2.3动物实验:雄性小鼠禁食、自由饮水12小时，共3只小鼠按80mg·kg-1羟基喜树碱的剂量灌胃给药。给药后24小时，取出肾组织，用生理盐水去除表面浮血，放入离心管中，置-20℃冰柜冷冻保存。RP-HPLC法测定生物样品中HCPT

4、的含量，所得数据用药动学计算软件（Kiics5.0）分析。2.4样品制备2.4.1标准曲线的制备:以HCPT标准肾组织样品浓度为横坐标，以色谱图中HCPT峰面积与CPT峰面积之比为纵坐标绘制浓度标准曲线，采用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线。HCPT在检测浓度线性范围为1.25-80ng·mL-1。小鼠肾组织样品典型的标准曲线回归方程Y=0.1627x+0.19090，r2=0.9993生物样品的制备。2.4.2空白组织（肾组织）样品制备:取空白组织匀浆100μL，依次加入内标溶液、HCPT系列标准溶液各100μL和1%乙酸200μL，加入乙

5、醚约700μL，将混合液涡旋1min、静音混合60min后，13000rpm离心20min，萃取液置于干净的离心管中，40℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200μL溶解，12000rpm离心5min，取上清液50μL进样。2.4.3给药后组织（肾组织）样品制备：取乙腈100μL代替空白组织，依次加入内标溶液、给药后组织匀浆各100μL和1%乙酸200μL，加入乙醚约700μL，将混合液涡旋1min、静音混合60min后，13000rpm离心20min，萃取液置于干净的离心管中，40℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200μL溶解，12000rpm离心5min，取上清液50

6、μL进样。2.5系统适用性试验：按“空白组织分析样品的制备”方法处理并分析，得到空白组织的色谱图；同法操作，获得一定浓度HCPT标准样品的色谱图及小鼠灌胃给药后组织样品的色谱图（图1）。结果表明，肾组织中的内源性物质不干扰HCPT的测定。2.6方法回收率和精密度试验：按“测定肾组织样品的HCPT溶液和内标CPT溶液”项下方法配制低、中、高三个浓度HCPT的质量控制（QC）样品，按“空白组织分析样品的制备”项下方法处理后进样，一天连续测定6次，随行标准曲线，计算日内精密度与准确度；每日各浓度1次，连续测定6天，随行标准曲线，计算肾组织样品测定方法日间精密度与准确度(表

7、2)。结果，日内的RSD<10.83%,日内精密度在89.82%~109.41%之间。日间的RSD<10.03%，日间精密度在89.82%~106.73%之间。2.7肾组织药代动力学：制作小鼠灌胃给药HCPT在肾组织中的药时曲线。图2是小鼠灌胃给药HCPT后肾脏中HCPT浓度与时间关系曲线。3讨论CPT和HCPT均为水不溶性物质，但化学结构中E环闭合的内酯结构在碱性条件下可开环形成可溶于水的羧酸盐形式，因此在分析样品中加入1％乙酸，以保证其E环内酯结构处于闭合状态。为了防止水溶性杂质对样品分析的干扰和对色谱柱的损坏，本研究采用液-液萃取法来处理样品，