higf1基因在退变椎间盘中的表达

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1、hIGF1基因在退变椎间盘中的表达【摘要】探讨hIGF1基因在退变椎间盘中的表达。［方法］参考文献〔1~3〕制备出椎间盘退变（intervertebraldiskdegeneration，IVDD）动物模型24只，随机分为Ad／CMVhIGF1、hIGF1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。L4、5、L5、6椎间盘中分别注射第2代Ad／CMVhIGF1（8×108PFU）、hIGF1生长因子（100μg/L）、PBS25μL。注射后1、2、4、8周，VhIGF1、hIG

2、F1蛋白表达持续达4周以上，hIGF1组表达持续约2周；PBS注射组无hIGF1蛋白表达。［结论］hIGF1基因能够在退变椎间盘中表达；hIGF1基因转染表达的持续时间长于单纯hIGF1生长因子直接注射。【关键词】椎间盘退变hIGF1Abstract：［Objective］TostudyhIGF1geneexpressiononintervertebraldiskdegeneration.［Method］TaleNeodelsadeaccordingtoreferenceandra

3、ndomlydividedintoAd／CMVhIGF1,hIGF1groicrolitrethesecondgenerationAd／CMVhIGF1（T=80×109PFU/L）,hIGF1groplesassintervertebraldisksidegelelectrophoresis（SDSPAGE）andtransferredtopolyvinylidenedifluoride（PVDF）Millipore.ThehIGF1groostequalbetpson等〔5〕检

4、测了多种细胞因子能够促进犬椎间盘细胞分泌细胞外基质，开始了生长因子应用于椎间盘的体外实验研究，而后相继出现了多篇文献报道〔6〕。但椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘细胞所处的内环境有明显差异；生长因子维持作用短暂；发挥作用需要多次或者连续给药，造成给药途径引发感染等；另外生长因子的费用亦不菲。转基因技术的发展为解决生长因子持续作用于椎间盘带来便捷之道。Nishida等〔7、8〕以腺病毒为载体，将LacZ基因、TGFβ1基因转染到正常成年兔椎间盘获得成功。但与正常椎间盘有明显区别的是，椎间盘发生

5、退变后，其细胞数量减少，功能不活跃，在生物学特性方面与正常细胞存在明显差异。退变的椎间盘细胞在椎间盘退变的生物学环境中能否被转染仍是未知。即便能够转染，转染后基因表达水平如何，能否起到修复IVDD的作用，均需进一步研究。本研究将自行构建的Ad／CMVhIGF1载体〔9〕直接注入新西兰大白兔IVDD模型〔1~3〕，观察hIGF1表达水平情况。1材料与方法1.1主要实验材料、仪器及设备蛋白质检测试剂盒（BioRad公司，美国）；鼠抗人IGF1单克隆抗体（RDSystemsInc，美国）；辣根

6、过氧化物酶结合的抗鼠IgG（SantacruzBiotechnology,英国）；预染蛋白质分子量Marker（Neresco，美国）；N，N，N，N四甲基乙二胺（Sigma，美国）；恒压恒流水平电泳仪及垂直电泳电转移槽（BioRad，美国）；XVhIGF1载体溶液的配制将hIGF1生长因子用PBS溶液稀释，分装入EP管中，每管2.5×10-3μg，-70℃保持。使用前加PBS至25μL，每个椎间盘注入的剂量为2.5×10-3μg。2结果注射后1、2、4及8周，SDSPAGE显示

7、3组实验动物的椎间盘组织均有不同分子量的蛋白条带，肉眼观察在蛋白表达量上无明显差异。VhIGF1注射组、hIGF1注射组均出现hIGF1蛋白带，其表达量大致相同，PBS注射组无目的蛋白带出现（图2）；注射后2周，Ad／CMVhIGF1注射组、hIGF1注射组仍出现hIGF1蛋白带，但hIGF1注射组表达量明显下降；注射后4周，Ad／CMVhIGF1注射组出现hIGF1蛋白带，但表达量已经开始下降，hIGF1注射组未出现hIGF1蛋白带（图3）；注射后8周，3组实验动物的

8、椎间盘组织均未出现hIGF1蛋白带。3讨论VhIGF1组hIGF表达的:蛋白marker;Lane1:注射后1周；Lane2：注射后2周；Lane3：注射后4周；Lane4：注射后8周图2注射后1周，3组hIGF1表达的：蛋白marker;Lane1:Ad／CMVhIGF1组；Lane2:hIGF1生长因子组；Lane3:PBS组图3注射后4周，3组hIGF1表达的：蛋白marker;Lane1:Ad／CMVhIGF1组；Lane2:hIGF1生长因子组；La