送检病料圆环病毒pcr检测与流行病学调查

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1、送检病料圆环病毒PCR检测与流行病学调查作者：李培龙摘要：豬圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属。是动物病毒屮最小的一员。该病毒可K期持续污染PK—15细胞，不岀现巨细胞病毒细胞病变(CPE)。临床上，II型圆环病毒(PCV-2)对猪有致病性，是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主耍病原体。目前，该疾病已经在W内外猪场广泛流行，给养猪业带来了很大的经济损失，引起世界各同的广泛重视。本项实验运用分子生物学方法(PCR)对广东广西某猪场送检的疑患PMWS的

2、病死猪进行诊断，记录结果并统计得出广东、广丙地区PCV—2的感染情况，并且分离出PCV-2基因组DNA,对其进行PCR扩增检测，并进行流行病学分析。克隆其ORF2基因并测序，与Genbank屮发表的W内外PCV-ii参考毒株进行核苷酸同源性比较，分析核苷酸序列的差异，S在分•了水平上对PCV-II进行初步的探究，为进一步研究奠定基础。关键词：PCV-2PMWSPCR0RF2圆环病毒断奶仔猪多系统衰竭综合症II型圆环痫毒(PCV-2)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主耍病原体，该痫最早发生于

3、加拿大(1991),此盾很快在世界各地(大洋洲除外)流行，亚洲及我同各地宥关的报道也越來越多，生物学家通过血清学方法和PCR技术在河北、北京、天津、山东、吉林、江苏、上海、河南、湖北和广东、广丙检测到了PCV-2。屮国农业大学杨汉春教授等对北京、天津、广东、山两等12个规模大猪场病原检测和流行病学调査，发现11个猪场存在PMWS的感染，一个猪场存在PDNS的问题，可见PCV-2在我国的普遍性。除PMWS外，PCV-2还与许多猪相关疾病的发生宥关。如PDNS(猪皮炎肾病综合征)、PNP(増生性坏死性肺

4、炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性震颤、肠炎等疾、疾病。PCV-2及其相关联的猪病已经在世界范闱内发生和流行，死亡率10-30%不等。严重发病的地区，暴发本病的猪场死淘率可高达40%以上。本项试验建立了II型圆环病毒(PCV-2)的分子生物学诊断方法，利用统计学手段得出了II型岡环病毒(PCV-2)在广东广西地区的感染情况，研究表明II型岡环病毒(PCV-2)在两广地区的感染程度比较严重，研究结果将在很多方面冇较高的参考价償，不仅为广人研制疫苗的企业提出新的课题，更加奋利于提出切

5、实可行的免疫预防计划，以减少II型圆环病毒(PCV-2)感染给养猪业造成经济损失。第一部分II型圆环病毒(PCV-2)PCR诊断方法的建立及流行病学调查分析1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源由广西、广东地区某些猪场送检的病死猪组织屮分离得到。1.1.2分子生物学常用试剂EXTaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000为TaKaRa产品；蛋白酶K购自上海生物工程有限公司；无水乙醇、氯化钙、氯仿与异丙醇等化学试剂均为W产分析纯产品。1.1.3其他试剂TNR:lMTris-HCl(PH8.0)

6、10ml；0.5MEDTA(PH8.0)50ml；20%SDS25ml；lMNaCl100ml；双蒸水815ml总体积为IL。0.5XTBE缓冲液：Tris-base5.4g,硼酸2.7g,0.5MEDTA2ml,加蒸馏水定容至IL。1.1.4主要仪器核酸扩增仪为BT0-RAD公司产品；高速冷冻离心机为SiGMA公司产品；DY—300型低压电泳仪为上海康达电子仪器厂产品；凝胶成像系统为珠海黑马医学仪器宥限公司产品;电子天平为上海天平仪器厂产品；超净台为苏净集团安泰公司制造。1.2方法1.2.1引物的

7、设计和合成在导师黄毓茂老师的指导下合成Y—对引物，对PCV-2全基因进行扩增。引物Pl:5’一CCGATATCTTCAACGCCCGCC—3’；引物1)2:5’一CCGCTCGAGTTAGGGTTTAAGTGGG—3’两引物间的理论跨幅为566bp,引物由上海博亚生物技术宥限公司合成并经PAGE电泳纯化，使用前用火菌三蒸水溶解，浓度为20ul/L,—20°C保存。1.2.2病毒DNA的提取研磨：将50mg左右病料组织在研钵屮充分研磨，越细越好，可加入少景也英砂。消化：转入离心管内，加入10倍体积的抽

8、提缓冲液TNE混匀，使组织碎片充分溶解其中，加入3ml蛋闩酶K，37"C水浴过夜。抽提：按照分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克，1992)方法进行。(1)在消化液中加入等体积的Tris炮和酌，充分混合，1200rpm离心lOmin。(2)小心吸取上清，力口入等体积Tris饱和酷，充分混匀，12000rpm离心5min。(3)小心吸取上清，加入等体积氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇=24:1)，12000rpm离心10mino(4)小心吸取上清，加无水乙醇至管U，一20°C