实验二紫外线诱变高产菌

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1、紫外线对淀粉酶产生菌的诱变效应姓名学号指导教师专业摘要：研宂了紫外线处理对产a—淀粉酶的影响。结果表明：采用30W紫外线照射90s获得较好的突变效果；利用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛，筛选得到1株理想的突变株UV-12,其酶活为3418.8U/mL,比出发菌株提髙了59.7%。关键词：a—淀粉酶；紫外线；诱变Abstract:TheUVmutagenesisinfluencedonu—amylaseyieldfromtheproducingstrainbacterialhasbeenstudied.Theresultsshowedthattheoptimalconditionswasi

2、rradiated90swith30WUV.AhighandstableyieldmutantwasachievedbyScreenedwithdiscoloredzoneandfermentedinshakeflask，andnamedUN—12.Thea—amylaseactivityofUN—12was3418.8U/mL,whichincreased59.7%comparedwiththeoriginalstrain.Keywords:ci—amylase;UV;Mutagenesisa—淀粉酶能以随机方式切断淀粉分子内的a—1，4葡萄糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、低聚糖、含a—

3、1，6键的糊精［1］因此它在淀粉深加工、酒精、食品、饲料、医药等领域有广泛的应用前景［2—3］。目前a—淀粉酶大多来源于微生物，产a—淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌和曲霉［4］。国外已有利用黑曲霉发酵生产a—淀粉酶的报道［5］。本实验以从土壤屮筛选出的产淀粉酶的菌株为出发菌株，进行紫外线诱变育种，旨在探索诱变条件，提高菌株产酶能力，为实现a—淀粉酶工业化生产奠定基础。1材料和方法1.1菌株土壤中筛选山的产淀粉酶的菌株1.2主要仪器和设备培养皿、移液管、刮铲、显微镜、紫外灯、磁力搅拌器、细胞计数平板等。1.3培养基(1)牛肉膏蛋白胨斜面培养基［6］;(2)固体鉴别培养基：可溶性淀粉5.Og

4、，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，琼脂10.0g，pH7.0,水lOOOmL;(3)液体发酵培养基：可溶性淀粉10.0g,蛋白胨5.0g,Na2HP04•12H204.0g,KH2P040.3g,pH7.0,水1000mL。1.4实验方法1.41菌悬液制备将筛选到的产酶能力较强的飽株从斜面接种到液体培养基屮371振荡培养2d,吸菌液以klO的接种量转接到液体培养基中继续培养Id后的菌液用于紫外诱变。1.4.2稀释培养后的菌液通过细胞计数计算其屮菌浓度，并用生理盐水将其•稀释到1000—2000个/ml,备用1.4.3紫外线诱变及筛选将紫外线灯开关打开预热约10分钟。取直径6cm无菌平

5、皿2套分别加入上述菌液5ml并放入无菌搅拌棒于平皿屮。将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上,一个平皿作为对照,不用紫外处理；另一平皿罝于30W紫外灯下30cm处间歇照射90秒，每个时间段涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作紈取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。然后川黑布包好置于37'C恒温培养箱中培养Id。注意每个平皿背面要标明处理时间。将培养Id后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液屮的活菌数。计算出紫外线处理后的存活细胞数及其致死率。存活率=处理后飽落数/对照菌菌数*100%致死率=（对照活菌落数-处理后活菌落数）/

6、对照活菌落数*100%将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加卢戈氏碘液数滴，在菌落周围将出现透明阓。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值、HC值等。与对照平板进行比较，根据结果说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜而上进行保存。2结果与分析：2.1诱变条件的选择对出发歯株分别用紫外线诱变处理，得到致死曲线见图1。由图1可知，出发菌株对紫外线比较敏感，而且致死率与诱变剂剂量存在正相关。当紫外线照射吋间为90s吋，致死率为72.8%,进一步提高照射时间，则致死率随之上升，当照射120s卩、b致死率为92.6%。一般认为，进行紫外诱变时，致死率为70%左右时突

7、变效果最好。因此，紫外线诱变的最适剂量为采用30W紫外灯照射90s。2.2筛选结果与出发菌株相比，经过紫外线诱变处理的菌株大部分酶活力有所提高，而且大部分致死率大的菌株其酶活也高。但也有致死率高而酶活较低的现象，如处理90s,120s的菌株。其中经过紫外线处理45s和60s的菌株的酶活力最强。透明圈最大，已使整个平板的淀粉完全分解,而经过15s处理的菌株其酶活力出现了倒退，低于出发菌株。结果如图。图一45S处理图二15S处理图四60S处理图三4