探讨高特异性vegf基因治疗对大鼠低血皮瓣存活的影响

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1、探讨高特异性VEGF基因治疗对大鼠低血皮瓣存活的影响-->探讨高特异性VEGF基因治疗对大鼠低血皮瓣存活的影响医学为了增加缺血组织的存活能力,许多能诱导新生血管形成的生长因子应用于缺血皮瓣的研究。其中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrog/kg肌肉注射麻醉,于大鼠背部设计蒂靠尾侧的单蒂型缺血随意皮瓣8cm×2cm。皮瓣内包括皮肤、皮下肉膜层、浅筋膜层。每块皮瓣选择二处注射位点,即分别距皮瓣蒂部2,6cm,距皮瓣边缘各1cm的肉膜层内。翻起皮瓣,用200μl微量注射器通过筋膜层向选定的二处注射位点分别注射pcD2/hVE

2、GF质粒200μl(0.2g/L);在对照组大鼠中于相应部位注射等体积量的等渗盐水。注射结束后,用3-0尼龙线将皮瓣原位间断缝合。1.3　检测指标1.3•1　肉眼观察:皮瓣颜色、质地、渗出、坏死范围及切割皮瓣出血等情况。1.3•2　皮瓣存活率的检测:术后7d将各大鼠皮瓣的彩色照片图像输入计算机,在真彩色医学图像分析系统(CMIAS)上测量每个皮瓣存活表面积及皮瓣总表面积,并求出它们之比×100%,为皮瓣存活率。1.3•3　单光子发射计算机断层摄影(SPECT)检测皮瓣血供的情况:术后7d,大鼠麻醉后,各组皮瓣

3、原位剥离创面基底部,仅留皮瓣蒂部与大鼠相连,将皮瓣向大鼠尾部翻转120°,置于大鼠尾巴旁。于大鼠尾静脉或后肢足背静脉注射1ml液体Sn+2-焦磷酸钠(PYP5mg,氯化亚锡0.5mg,等渗盐水1ml)30min后,再注入99mTc1ml(55.5MBq),利用SPECT检测99mTc-RBC在皮瓣血液中分布情况,并予即时照相。每个大鼠的缺血皮瓣都作为感兴趣区,采集的最大计数数据在矩阵64×64、持续180s由计算机自动获取。1.3•4　VEGF基因在缺血皮瓣中的表达:术后7d处死大鼠,切取有活力的皮瓣组织,TRIzol试剂盒(美国G

4、IBCO公司)提取RNA。分光光度计测定RNA量,10g/L琼脂糖凝胶电泳测定总RNA质量。取5μl(1μgRNA)逆转录后各取2.5μl进行聚合酶链反应(PCR,美国Promega公司)。PCR反应体系为50μl,反应条件为:94℃预变性5min,然后94℃,30s;55℃,45s;72℃,55s,30个循环,72℃延伸5min。VEGF正义引物序列为:5’-GGGGGATCCGCCTC-CGAAACCATGAACTT-3’;反义引物序列为:5’-CCCGAATTCTCCTG-GTGAGAGATCTGGTT-3’,扩增产物的片段为550bp。

5、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydroge-nase,GAPDH)为内参照。GAPDH的正义引物序列为:5’-TCCCTCAAGATTGT-CAGCAA-3’;反义引物序列为:5’-A-GATCCACAACGGATACATT-3’,扩增产物的片段为309bp。取10μlPCR产物上样,20g/L琼脂糖凝胶电泳。扫描电泳照片,应用CMIAS测定PCR产物条带灰度,以VEGF与相应GAPDH基因条带灰度的比值作为结果进行对比。1.3•5　VEGF蛋白质在缺血皮瓣中的表达:将上述切取有活

6、力的皮瓣组织,常规石蜡包埋切片。兔抗VEGF多克隆抗体及免疫组化检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司,按试剂盒说明书进行免疫组化染色。1.3•6　皮瓣皮下血管密度的检测:上述石蜡包埋组织切片,按试剂盒说明书进行兔抗鼠LAMININ(层黏连蛋白)(武汉博士德生物工程有限公司)的免疫组化染色。在10×40倍光镜下每张切片随机计算10个视野中血管断面数目,利用CMIAS测量出血管断面面积及相同视野下的组织面积,求出每平方厘米组织中血管断面的数密度或者面密度。1.4　统计学分析数据用-x±s表示,两组样本的比较采用双侧t检验,P2　结果

7、2.1　肉眼观察成活皮瓣表现为质地柔软、红润,用刀切割时出血;坏死的皮瓣质硬、黑色,用刀切割时不出血。与对照组相比较,治疗组的皮瓣坏死面积较小,位于皮瓣远端。2.2　皮瓣存活率治疗组的皮瓣存活率为(86.73±4.67)%、对照组为(46.35±5.86)%,两者之间的差异有非常显著性意义(P2.6　皮瓣皮下血管断面密度兔抗鼠LAMININ免疫组化染色的切片在光镜下观察,治疗组皮瓣有更多的毛细血管、新生血管萌芽(图2)。用CMIAS检测各组皮瓣皮下血管断面的数密度和面密度(表1)。其结果显示,治疗组皮瓣皮下血管断面的数密度、面密度均显著高于对照

8、组(P3　讨论VEGF是一种分泌性糖-->蛋白和特异性新血管形成的丝裂原,能够诱导新血管形成、提高缺血皮瓣的生存率[1,3]。然而VEGF蛋白质这种效