探讨癫痫体外模型中海马神经元的电生理死亡特性

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1、探讨癫痫体外模型中海马神经元的电生理死亡特性-->第一部分无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型的建立及形态学、电生理学观察目的建立无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型，观察自发性癫痫放电对体外培养大鼠海马神经元细胞及电生理学特征的影响。方法采用新生24h内的Sprague-DaV,动作电位幅度为15~30mV。神经元在无镁刺激过程中，放电形式发生改变，表现为持续强直性高频爆发和“楔形”去极化。经无镁处理3h并恢复正常培养基后，表现为阵发性持续棘波样爆发，另外存在有“楔形”去极化及阵发性去极化偏移(paroxysmaldepolarizingshifts,PDS)

2、。无镁刺激恢复正常持续至96h仍可检测到周期性自发放电表现。结论1.本研究所用方法培养的大鼠海马神经元在数量、纯度、存活时间方而较好，表而光滑，轮廓淸楚，有较强的立体感，具有适于膜片钳研究的细胞结构基础。2.木模型中海马神经元虽为体外培养，但神经元之间能形成广泛的突触网状联系，具有信息传递的形态学基础。3.无镁刺激能诱发神经元产生持久的自发性反复性放电，与癫痫发作时电生理活动类似，具有体外癫痫细胞模型研究的电生理基础。4.无镁诱导海马神经元癫痫放电模型稳定可靠、可控性强，是良好的癫痫细胞模型，为研究癫痫病理生理机制及新型抗癫痫药物的研发提供了良好平台。第二部

3、分PARP-1调控无镁致痫大鼠海马神经元中AIF表达、分布及PI3K/Akt信号通路的机制研究目的评估无镁大鼠海马神经元癫痫放电模型中的细胞生存状态；探讨神经元内AIF的表达、分布及PI3K/Akt信号通路随时间的变化规律；探讨PARP-1及其抑制剂DPQ(3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxy]-l(2H)-isoquinolinone)对上述指标的调节作用及相关机制。方法1.将体外培养至14d的大鼠海马神经元随机分为对照组、无镁组、无镁+Z-VAD-FMK(Caspase抑制剂）组、无镁+DPQ组，均选用致痫后lh、

4、24h两个时间点，采用TUNNEL及LDH检测法，评估无镁神经元死亡情况,并探讨DPQ对其影响。2.将大鼠海马神经元随机分为对照组、无镁组、无镁+DPQ+K组及无镁+DPQ组的该比例分别降至45.25%和26.88%,LUH输出率分別为无镁24h组的57.35%和36.94%。2.PAR的蛋白量在无镁诱导3h后显著升高，24h达最高水平，线粒体中AIF表达量随时间降低，诱导后24h达最低水平(p第一部分无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型的建立及形态学、电生理学观察前言...........16材料与方法...........17结果...........22

5、讨论...........23结论...........28附图表...........29第二部分PARP-1调控无镁致痫大鼠海马神经元中AIF表达、分布及PI3K/Akt信号通路的机制研究前言...........31材料与方法...........32结果...........41讨论...........43结论...........50附图表...........51第三部分PARP-1调节无镁致痫人鼠海马神经元中NAD+及SIRT1水平的机制研究前言...........57材料与方法...........58结果...........67讨论.

6、..........69结论...........74附图表...........75结论：无镁诱导大鼠海马神经元癫痫模型中，PARP-1被过度激活，并导致AIF由线粒体向细胞核转位，神经元大量死亡。而PARP-1抑制剂DPQ通过激活P13K/Akt/GSK3β信号通路，抑制AIF向细胞核的转位，减少神经元死亡，发挥了细胞保护作用。在无镁诱导大鼠海马神经元癫痫放电模型中，-->PARP-1被过度激活，生成大分子PAR的同时消耗大量NAD+,一方面引起細胞内能量衰竭、线粒体膜上极化、MPTP开放及AIF由线粒体向细胞核转位，导致非Caspase依赖性的细胞死亡

7、；另一方面,减少SIRTI反应底物，制约其去乙酰化活性，导致某些促细胞死亡因子过乙酰化而活性增强，诱导神经元死亡。