发酵蜈蚣粉中总黄酮类含量测定的方法学研究

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1、发酵蜈蚣粉中总黄酮类含量测定的方法学研究目的]建立紫外可见分光光度法测定发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物含量的方法。[方法]通过醇水提取发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物，在510nm下测定其吸光度并计算其含量。[结果]黄酮类化合物浓度在0.02～0.10mg/mL时，其浓度与对应的吸光度呈良好的线性关系;在精密度试验中，发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物的平均吸光度为0.4205，RSD=0.7407%;在重现性试验中，发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物的平均质量比为9.091mg/g，RSD=2.007%;在加样回收率试验中，其平均回收率

2、为97.92%，RSD=1.568%。[结论]采用紫外可见分光光度法对发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物含量进行测定，其精密度、重现性、回收率均良好，可用来测定发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物的含量。蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)的干燥体，其辛味，性温，有毒[1]。蜈蚣作为传统中药材，具有息风止痉、解毒散结、通络止痛的作用[2]，临床常用于治疗肿瘤、原发性高血压、糖尿病及并发症、神经性头痛、偏头痛等[3-4]。而黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化压力和促进抑癌基

3、因表达的作用[5]，因而成为人们研究的热点。通过使用球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)对蜈蚣进行发酵可以提高蜈蚣中黄酮类物质的含量，增强其解毒散结的功效，还可以较大幅度地改变药性、提高疗效、降低毒副作用[6]。笔者通过紫外可见分光光度法对发酵蜈蚣粉总黄酮类化合物含量进行测定，并对其方法学进行考察，旨在为今后发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物药理活性研究提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1仪器。UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，KQ-500E

4、型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，ST16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，SK-1快速混匀漩涡器(中国深圳)，远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)，梅特勒—托利多分析天平(上海先悦机电有限公司)。1.1.2试剂。芦丁对照品(中国医药上海化学试剂公司);乙醇、亚硝酸钠、六水氯化铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯。1.1.3供试品。蜈蚣粉购自安徽亳州市(批号：20150730)

5、，经山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定为少棘巨蜈蚣粉(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)。发酵蜈蚣粉(批号：20150801)由山东中医药大学化学实验室自制。1.2试验方法1.2.1芦丁标准品溶液的制备。精密称取芦丁对照品20mg，用60%乙醇溶解后，移入100mL容量瓶定容至刻度线，摇匀，即得浓度为0.2mg/mL的标准溶液，置于4℃冰箱保存备用。1.2.2发酵蜈蚣粉的制备。称取适量灭菌后的少棘巨蜈蚣粉，加入活的白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)V

6、uill)孢子粉混悬液(100亿/g，山东农业科学院植物保护研究所自筛菌株——桃5)，再加入适量吐温-80助溶，用适量灭菌水将其稀释为含1×108个孢子的混悬液，拌匀湿润，在温度25～28℃、湿度95%的条件下，在恒温恒湿培养箱中发酵8d左右，待长满菌丝后停止发酵。1.2.3蜈蚣粉醇提液的制备。精密称取发酵蜈蚣粉1g(料液比为1∶30)，加入30mL80%乙醇，超声20min，于100℃下回流2.5h，进行抽滤，取上清液于8000r/min离心20min，收集上清液于50mL容量瓶中定容，置于4℃冰箱保存备用。1

7、.2.4紫外可见分光光度法测定发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物。1.2.4.1标准曲线的绘制。分别精密量取“1.2.1”的标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL试管中，先加30%乙醇至5mL，再加5%亚硝酸钠溶液0.3mL;摇匀后静置6min;然后加10%六水氯化铝0.6mL，摇匀后静置5min;最后加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，并用30%乙醇稀释至刻度，摇匀后于510nm处测定其吸光度。以芦丁标准品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.4.2精密度试验。精密称取发酵蜈蚣粉2

8、g，按“1.2.3”的方法提取试样液并吸取此试样液，重复取样5次，每次2mL，分别用紫外可见分光光度法在波长510nm下测定其总黄酮类化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，并计算相对标准误差RSD。1.2.4.3重现性试验。精密称取发酵蜈蚣粉2g，共5份，按“1.2.3”的方法提取试样液并吸取此试样液，在波长510nm下测定其总黄酮类化合物的吸光度，方法同“1.2.4