应用基因芯片技术研究骨巨细胞瘤的基因

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1、应用基因芯片技术研究骨巨细胞瘤的基因【】目的运用基因芯片技术研究骨巨细胞瘤差异性基因表达。方法提取手术切除新鲜gctb标本8例及4例正常骨痂的细胞总rna，应用含有8064个人类基因点的cdna表达谱芯片基因芯片筛选差异性表达基因,amershampharmaciagenⅲ扫描杂交信号，用imagequant软件分析实验结果。结果8例骨巨细胞瘤患者与正常人群相比较基因表达差异的比例约占总数的26%，两者间的基因表达差异具有统计学意义（p0.01），表达差异五倍以上的基因47个,其中25个基因表达明显上调,22个基因表达明显下调，以细胞外基质调节基因、肿瘤相关基因、细胞因

2、子类基因为主要类别。结论基因芯片技术对骨巨细胞瘤分子水平病理机制研究有重要意义，为其诊断治疗进一步提供了线索。【关键词】基因芯片骨巨细胞瘤基因差异性基因芯片技术是近年发展起来的一项新技术，可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析，从而高效快捷地测试和分析基因、配体、抗原等生物活性物质。骨巨细胞瘤为好发于青少年长骨干骺端的低度恶性或潜在恶性肿瘤，生物学行为多变，故其治疗效果往往欠佳；至今其发病机制仍未清楚。本研究利用基因芯片技术鉴别骨巨细胞瘤差异表达基因谱，进而探索研究骨巨细胞瘤分子水平致病机制。1材料与方法1.1实验仪器和软件eppendorf台式微型离心机(ep

3、pendorfltd.)、eppendorf5810r冷冻桌面离心机(eppendorfltd.)、geniiimicroarrayspotter芯片点样仪(amershampharmaciabiotechltd.)、generationⅲarrayscanner芯片扫描仪(amershampharmaciabiotechltd.)、shellabgeneralpurposeincubator恒温杂交箱(shellabltd.)、bioradminisubgtsystem电泳设备(bioradltd.)、du520uv/visspectrophotometer紫外

4、分光光度计（beckmancoulterltd.）、vilbergeldocumentationsystem凝胶成像仪(vilberltd.)、uvcrosslinker（viberlourmatfrance）紫外交联仪、midas8064点基因芯片（chipscreenbiosciencesltd.）、图像扫描软件imagequant(amershampharmaciabiotechltd.)、图像分析软件arrayvision6.0(imagingresearchltd.)、实时荧光定量pcr通用系统（abi）。.133229.1.2实验试剂trizolreagen

5、t(lifetechnologies,inc.)、qiagenerneasyminikit(qiagen,inc.)、qiagenepcrpurificationkit(qiagen,inc.)、ambionmessageamparnakit(ambion,inc.)、cyscribecdnalabelingkit(amershampharmaciabiotech,ltd)。1.3标本采集分组及rna提取取自2002～2004年本院及广州华侨医院、中山大学附属一院手术切除新鲜标本8例(术中判断及术后病理证实为gctb),jaffe:i级6例、ii级1例、ⅲ级1例；cam

6、panacci分级:i级6例、ii级1例、ⅲ级1例；enneking分期:g0t1～2m05例、g1t1～2m02例、g2t2m01例；部位:股骨远端5例、胫骨近端2例、桡骨远端1例；年龄23～55岁，平均34岁；男5例、女3例。对照组4例，取自胫骨和股骨骨折内固定取出术中的正常骨痂，男女各2例、年龄23～50岁，平均30岁。所有标本均分成约1cm×1cm×1cm小块,于离体30min内保存于液氮中。组织样品加入适量体积的trizol后采用自动匀浆器至完全匀浆，加入适量的氯仿、r乙酸钠静置至沉淀后加入适量depc水溶解沉淀，测定rna样品浓度和总量，取样品琼脂糖凝胶电泳

7、鉴定rna的质量并将合格样品保存于－80℃归档（浓度达试验要求的20μg量,其ａ260/ａ280比值不低于1.8）。1.4实验方法1.4.1探针标记样品rna和secondroundprime、spikerna在70℃混合变性、冷却各5min后，在42℃条件下和0.1mdtt、dyedctp、dntpmix等反应2h，反应完毕后采用qiaquickpcrpurificationkit纯化，加入适量bufferpb混匀后逐步离心，可得57μl产物。1.4.2预杂交或预处理将放入玻片的片夹放入200～250ml预热至55℃预杂交缓冲液的染色