浅谈心肌细胞培养技术及其进展

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1、摘要：细胞培养技术是生物医学研究中最常用和最重要的技术之一，本文就心肌细胞的经典培养模型和新进展作一综述。关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养Abstract：Cellcultureisoneofthemostcommonlyusedandthemostimportanttechniquesinthebiomedicalresearch.Inthispaper，theclassicalcardiomyocyteculturemethodsandthelatestprogressinthisfiel

2、darereviewed.Keywords:Cardiomyocyte；Cellculture；Three-dimensionalcultivation细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。在体细胞研宄存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。细胞培养(cellculture)是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。可以说，细胞培

3、养技术是生物医学研宄中最基础最重要的技术之一。本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。1经典心肌细胞培养模型鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞(immaturecardiomyocyte，ICM)和成熟心肌细胞(adultcardiomyocyte，ACM)两种。ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的［1］，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法P］。ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3d内的乳鼠心室肌细胞最常用。ACM相互间有大量闰盘和外基质紧密相连，

4、又没有分裂增殖能力，其分离和培养比ICM要困难得多，直到上世纪60年代才通过逆行主动脉生物酶灌注法分离出单个ACM［3］,但是当时ACM因置于生理浓度钙溶液中而迅速死亡，这个现象被称为”钙反常(calciumparadox)n［4］。1976年，Powell首次报道了分离活性的钙耐受成熟心室肌细胞的技术［5］。Jacobson则在1977年首次成功培养出ACM。经典的心肌细胞培养技术包括细胞分离、纯化、接种、培养和传代培养等步骤。1.1心肌细胞的分离ICM的分离一般采用组织块消化法，即将心肌组织剪

5、成小碎块，然后加入消化分离液将心肌细胞和非心肌细胞分开。消化分离液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶［6］，其中胰蛋白酶作用最强，但也最容易损伤心肌细胞；胶原酶作用温和；透明质酸酶作用弱，不宜单用。目前多采用两种或三种消化酶联合，以胰蛋白酶和胶原酶I联合最常用。消化分离液中可加入牛血清白蛋白以保护心肌细胞，提高细胞质量［7］;也可加入脱氧核糖核酸酶，防止DNA聚积在心肌组织表面而影响分离效率［6,8］;乙二胺四乙酸（EDTA）是一种常用的螯合剂，能吸附溶液中的Ca2+、Mg2

6、+等金属离子而促进细胞分离（细胞间粘附因子发挥作用需有上述金属离子存在），而且对细胞功能影响极小［9］，故加入EDTA可进一步提高分离效率，但是EDTA不能被血清中和，后续必须洗净，以免影响细胞贴壁。心肌细胞分离后加入含胎牛血清的培养液以终止消化，即得到初步的心肌细胞悬液［10］。在实际操作中，消化分离液的酶类、酶浓度、温度、搅拌转速及时间长短等因素相互影响、相互制约，需要反复摸索才能得到最佳方案。ACM的分离方法相对更复杂，主要有组织浸泡法、贴块培养法和离体心脏生物酶灌注法。效果最好和最常用的是

7、离体心脏生物酶灌注法，又称为Langendorff离体心脏灌注法，是OscarLangendorff在1895年发明的［11］，经过预热、消毒、洗涤、经升主动脉逆灌消化酶溶液循环灌流、震荡释放心肌细胞和梯度复钙等步骤，最终得到活性的单个ACM［12,13］。1.2心肌细胞的纯化心肌组织由多种细胞构成，以心肌细胞和成纤维细胞样细胞数量最多。在体外培养的特殊环境中，非心肌细胞对心肌细胞的影响是巨大的，主要表现在：①非心肌细胞贴壁和生长增殖能力更强，容易成为优势细胞，通过空间竞争、分泌抑制因子等机制影响

8、心肌细胞的生长增殖和功能［14，15］；②非心肌细胞对干预因素的反应与心肌细胞不同，影响实验结果。因此，细胞分离后的纯化是必要的。常用的纯化方法有差速贴壁法和化学试剂法，主要是除去成纤维细胞样细胞：①差速贴壁法利用不同细胞贴壁速度的不同（心肌细胞贴壁较慢）进行分离和纯化。通过差速贴壁法纯化的心肌细胞纯度可达到90%以上［16，17］，且操作简单、成本低、对心肌细胞影响小，但缺点是作用时间短，不能单独用于长时间培养的实验；②化学试剂法利用某些化学试剂对不同细胞的抑制强度不同来达到纯化