农产品中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的液质联用检测分析

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1、农产品中黄曲霉毒素BI、B2、Gl、G2的液质联用检测分析淮安市疾病预防控制中心淮安223001摘要：目的应用液质联用（LC-MS/MS）技术，建立农产品中黄曲霉毒素BI、B2、Gl、G2的定量检测方法，对市场中的农产品进行分析。方法样品粉碎后经乙腈水（84+16）提取，不经免疫亲和柱净化，氮吹浓缩定容后过0.22μm滤膜。滤液经反向C18柱分离，以0.1%甲酸水-甲醇作流动相梯度洗脱分离4种黄曲霉毒素。质谱采用电喷雾离子化源（ESI）,正离子模式扫描。结果4种毒素在各自的定量范围内均呈良好的线性关系，r>0.990,回收率>；80%,且与经免疫亲和柱净化相比，具有较高的回

2、收率。结论该方法具有简便、快速、经济、灵敏、准确等优点，适用于多种农产品中黄曲霉毒素的检测。关键词：液质联用技术；农产品；黄曲霉毒素黄曲霉毒素（aflatoxin，简称AF）是目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，广泛污染农作物、食品、饲料，严重威胁人类健康和生命安全，已经引起社会的普遍关注［1］。目前己分离出的黄曲霉毒素及其衍生物共二十多种，伍括黄曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2等，B1的毒性最大。普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中，直接或间接进入人类食物链，结构也比较稳定，在食物的热加工过程中都不易被破坏［2-3］。黄曲霉毒素有极强的致癌性［4-5］,长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。目前检测黄

3、曲霉毒素的常规方法主要有薄层色谱法［6］、酶联免疫吸附法［7］、二维薄层色谱法［8］、高效液相法9］。薄层色谱法操作繁琐、而且有机试剂用量大、污染严重、灵敏度低、定量差、耗时长；高效液相色谱法需要使用荧光检测器，样品需要在柱前或柱后进行衍生，分析时间较长、步骤多、损失不易控制；酶联免疫吸附法虽然前处理过程简单，但特异性差易出现假阳性。高效液相色谱-串联质谱联用技术（HPLC-MS/MS）具有选择性高、灵敏度好、不需要衍生化等优点，近年来，液质联用技术在食品安全领域得到广泛泣用，它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，可以对很多种类的化合物进行定性定量分析。目前国内对真菌

4、毒素的HPLC检测多侧重于采用免疫亲和柱或多功能浄化柱的方法进行样品浄化，但在净化的过程中也带来了待测组分的损失，同时各种纯化柱的价格昂贵，无法重复使用，检测成本高［10］。本研究应用HPLC-MS/MS法，通过优化样品提取方法和色谱质谱检测条件，建立一套可以对多种农产品中黄曲霉毒素BI、B2、Gl、G2同时进行定性定量检测的简便、快速方法。1仪器与试材1.1仪器与设备AgilentTechnologies1290超高效液相色谱-API4000串联四级杆质谱仪（美国AB公司），配有电喷雾离子源（ESI）;超纯水发生器（美国LABCONCO公司）；高速电动匀浆器（FSH-II型）；TGL-1

5、6台式高速冷冻离心机（湖南湘仪）；氮吹仪（美国TECHNE）;电子天平（感量O.OOOlg,梅特勒）；DIKMA氨基固相萃取小柱；食品料理机（欧科）。1.2材料与试剂大米、花生、玉米粉（渣）、芝麻、面粉市购。黄曲黄曲霉毒素标准溶液，AFB12.0μg/ml，AFB22.0μg/ml,AFG12.0μg/ml,AFG22.0μg/ml（农业部环境保护科研监测所，编号SB05-195〜198-2008，批号1405）;甲醇、乙腈（色谱纯，德国，Merck）；醋酸铵、甲酸（色谱纯，美国，Dikma-Pure）；超纯水（由超纯水发生器产生）。黄曲霉毒素净化柱（美国，LCTe

6、ch）2方法与结果2.1色谱条件AgilentPoroshelll20ec-C18色谱柱（2.1mm×75mm,2.7µm）；流速0.3mL/min;柱温：35°C；进样量：2µl；流动相A-甲醇，B-0.1%甲酸水溶液（pH3.0）。梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。2.3混合标准品溶液的配制精密吸取黄曲霉毒素标准溶液各250μl，混匀，4°C保存备用。2.4样品处理称取2.0g粉碎好的样品置于100mL离心管中，加10mL乙腈-水溶液（84:16,V/V）,浸泡20分钟,高速匀浆3min，5000r/min下离心10min,取ImL上清液氮气吹干（

7、室温），残渣准确加入1mL甲醇溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。2.5标准曲线的绘制取“2.3”项下的混合标准品溶液，加甲醇分别配制成浓度为的0.01,0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0μg/mL的混合标准品溶液，按上述色谱质谱条件注入液质联用仪进行分析，结果见表3,可见4种真菌毒素在各自浓度范围内具冇良好的线性关系。2.6检测限（LOD）、定量限（LOQ）和精密度取中间浓度的