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时间:2018-10-25
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1、HSVsup2;TK与ILsup2;2共表达真核载体的构建及其在【】目的构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)和人类细胞因子白细胞介素2(il2)的联合表达质粒载体并观察其在人类肺腺癌细胞系a549细胞中的表达。方法设计、合成多克隆位点(mcs)插入到质粒psnav中,然后分别从其他不同的质粒剪切片段hsvtk、内部核糖体进入位点(ires)、il2并依次接入到mcs中,最终得到目的质粒psnavtkiresil2(pmtⅱ)。目的质粒经酶切、dna测序鉴定正确后,转染到a549细胞中。用rtpcr方法、elisa
2、法检测转染后细胞目的基因的转录和表达;进一步倒置显微镜观察、mtt法检测更昔洛(gcv)对转然后细胞的杀伤作用。结果经酶切、dna测序、rtpcr法和elisa法鉴定,双基因真核表达载体pmtⅱ序列正确并能有效表达。进一步倒置显微镜观察和mtt法检测表明hsvtk/gcv自杀基因系统对a549细胞有明显的杀伤作用。结论成功构建了pmtⅱ真核表达载体,并观察了其对a549细胞的杀伤效应,为进一步研究hsvtk/gcv联合il2基因治疗肺癌提供实验基础。【关键词】肺癌基因治疗单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)il20引言肺癌是常见
3、的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年上升,在我国城市人口中,它的病死率居各类恶性肿瘤之首。.133229.如何进一步提高治疗效果,降低死亡率一直是人们研究的重要课题。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因系统(hsvtk/gcv)以其具有的自杀效应在很多肿瘤的治疗研究中都显示了有效的作用,尤以其独特的“旁观者效应”受到广大研究者的青睐,在针对肺癌方面也有一定的治疗作用[1]。但是肺癌的发生、发展是一个多步骤、多基因参与的过程,而且不同组织类型肺癌细胞其自身生物学特性也存在很大差异,因而国内外有学者提出单一的基因治疗对肺癌细胞的
4、杀伤作用有限[23],宜采用联合治疗来提高有效性。近些年肿瘤的th1/th2免疫反应状态也是国内外研究的热点之一,有文献报道在肺癌患者体内存在thl/th2细胞因子的平衡失调,发生了th1向th2的异常漂移,存在il2等th1细胞因子分泌的不足[46]。而且临床上单独应用il2治疗肺癌及恶性胸水也显示了一定的治疗作用[7]。基于以上的理论和实验基础,联合hsvtk和il2的双基因治疗有可能提高单基因治疗的效果。在本实验中,我们构建了含有hsvtk与il2双治疗基因的真核表达载体,并初步观察了它在体外对非小细胞肺癌株a549的杀
5、伤效应,为进一步基因治疗研究奠定实验基础。1材料和方法1.1材料腺相关病毒载体psnav购自北京本元正阳生物有限公司;psc11tk、pcdnail2为美国梅尔医学院石长信博士惠赠;pireseyfp为加拿大多伦多大学温晓燕博士惠赠;肺腺癌细胞系a549细胞,大肠杆菌dh5α为本室保存;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、dna连接酶试剂盒、去磷酸化酶试剂盒均为takara公司(日本)产品;trizol试剂、lipofectamine2000为invitrogen公司(美国)产品;各种限制性内切酶为fermentas公司(美国)产品
6、、taqdna聚合购自赛百胜公司(上海);逆转录酶、rna酶抑制剂为promega公司产品(美国);gcv为湖南五洲通制药有限公司产品;elisa试剂盒购自上海西塘(进口分装),胎牛血清为杭州四季青公司产品。mcs序列、引物序列以及基因测序由上海生工、上海博亚生物工程有限公司完成。1.2方法1.2.1psnavtkiresil2载体的构建psnav本身cmv启动子后的限制性内切酶位点较少,根据插入片段所需内切酶设计、合成mcs,插入载体中。从其他质粒中剪切需要的片段hsvtk、ires(其前接有一段增强表达的ivs序列)、il
7、2并按不同的酶切位点依次插入mcs多克隆位点中,得到最终目的质粒psnavtkiresil2(pmtⅱ),酶切鉴定正确后送公司测序。在此构建过程中同时可获得只含有hsvtk片段的对照质粒psnavtk(pmt)。目的质粒构建流程如图1所示:图1psnavtkiresil2(pmtⅱ)的构建流程(略)fig1constructionofpsnavtkiresil2(pmtⅱ)1.2.2细胞培养及基因瞬时转染细胞生长于含10%胎牛血清的dmem的培养基中,在37℃、5%co2饱和湿度的温箱中培养。细胞分为三组,每组三孔:(1)a5
8、49/pmtⅱ组,转染质粒pmtⅱ;(2)a549/pmt组,转染质粒pmt;(3)a549组,未转染质粒。每个实验重复三次。转染前一天以105细胞接种于24孔板。待细胞生长达到90%融合时,按脂质体lipofectamine2000操作说明书转染质粒。转染时细胞换无血清培养
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