elisa方法学验证

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1、乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证课程要求掌握：①乙肝表面抗原的ELISA法定量检测方法；②ELISA法方法学评价的方法。熟悉：①定量检测的酶标仪操作要领；②各种缓冲液的配制。了解：ELISA检测中的影响因素和注意事项。试验目的进行乙肝表面抗原ELISA法定量分析的方法学验证。试验材料1试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。2仪器及酶标板酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：MilliporeElix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。3溶液配制0.01MpH7.4的PBS缓冲液

2、：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。质控品：用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。试验方法1标准曲线各浓度的配制用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/ml。2测定方法设计标准品、质控品及空白分配方案；取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按需要重新配制；在相应孔中加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul；37℃温育30min，洗板4次；加入酶标抗体，生物素二

3、抗，50ul/孔；37℃温育30min，洗板4次；加入A、B液,50ul/孔，37℃温育15分钟。加入终止液，50ul/孔。3标准曲线制作及结果计算酶标板放入酶标仪，盖上盖子；在电脑上打开MicroplateManager5.2软件选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。ELISA法标准曲线示意图4准确度（回收率）计算按示例表1样式列表并计算回收率。VEGFR2-Fc(ng/ml)测定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)2021.765

4、108.825103.1599.1517.78988.94520.301101.50522.612113.0620.692103.461011.279112.79116.0923.8211.148111.4811.739117.3911.828118.2812.052120.5256.467129.34102.52815.884.69593.94.41988.385.123102.464.92898.565按示例表列表并计算精密度。板内精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）测定值RSD(%)123452021.76517.78920.30122.61320.69220.632±1.838.

5、871011.27911.14811.73911.82812.05211.609±0.383.2756.4674.6954.4195.1234.9285.126±0.7915.41板间精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）测定值RSD(%)2021.76419.26221.5197.78914.76015.63020.30116.95517.86222.61219.64322.16020.69218.14420.43919.302±2.3912.381011.27810.09012.17311.1489.92811.86911.73910.45912.55811.82810.47912.4

6、5512.05210.70912.58411.423±0.917.9756.4765.6886.7344.6954.0634.7864.4173.7884.4935.1234.4635.3244.9284.2735.1354.959±0.8316.7376检测限（LOD）计算：取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。注意事项标准品和质控品配制要准确。实验各个环节都很重要，每步操作都要认真。讨论1.实验背景介绍（目的、采用的方法、检测原理、方法学验证的基本知识介绍）2.本实验的设计及实施特点3.实验结果分析4.临床应用及分析本实验报告要求按科研论文格式有摘要和关键词字数不限以WORD形式打印，元

7、月18日前集体上交。