减毒麻疹病毒诱导子宫内膜腺癌细胞凋亡的策略

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1、减毒麻疹病毒诱导子宫内膜腺癌细胞凋亡的策略子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以于内膜腺体的腺癌最常见。为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%。近年来发病率在世界范围内呈上升趋势。早期患者预后较好，而晚期患者多有盆腔外转移，预后差，虽然采用手术、放射、药物等综合治疗，但5年生存率仍较低，因此寻找新的治疗方法迫在眉睫[1]。溶瘤病毒治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗途径，其机制在于利用基因工程对病毒进行改造，使其在肿瘤中选择性复制并产生溶瘤作用[2]。病毒溶瘤结合其他治

2、疗，使得肿瘤治疗的疗效显著提高，得到我国政府的重视，不断加大投入，相继启动了一些与溶瘤病毒学密切相关的重大研究项目。麻疹病毒（MV）感染可诱导多种细胞凋亡，利用MV这一感染特性，有研究人员开展了利用MV治疗淋巴瘤、脑肿瘤、卵巢癌等的研究，并获得了较好的疗效[3-7]。尤其是利用基因重组的MV-CEA、MV-NIS（MV与放射性碘化钠的重组体）治疗卵巢癌的方法已用于一期临床试验[6-7]。JEC是一株人子宫内膜腺癌细胞系，研究证实子宫内膜腺癌细胞表面表达麻疹病毒结合受体CD46[8]。因此设想麻疹病毒是否对子

3、宫内膜腺癌有抑制作用；其抑制作用是否通过诱导细胞凋亡实现？因此，本实验通过不同浓度的MV感染JEC细胞，然后观察不同感染浓度及时间细胞的增值及凋亡情况，并对病毒感染前后细胞Fas、FasL、TGF-的表达进行测定，初步探讨MV对JEC的抑制作用及其相关机理，为利用MV对子宫内膜癌进行溶瘤治疗的进一步研究提供实验依据。1材料与方法1.1材料麻疹病毒疫苗京160（北京天坛生物制品股份有限公司）；JEC细胞（遵义医学院微生物教研室）；Annexin-vFITC/PI试剂盒（晶美生物工程公司）；兔抗Fas、兔抗Fa

4、sL、兔抗TGF-（SantaCruz公司）；小量凋亡DNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）。1.2方法1.2.1病毒感染浓度的选定TCID50测定按照中国生物制品规程操作，对病毒进行倍比稀释，接种JEC细胞，每个稀释度设4复孔，并设空白对照，置37℃、相对湿度97%、5%CO2孵箱中连续培养，观察7d，以第7天感染细胞出现2孔或2孔以上多核巨细胞病变的病毒的最高稀释度作为病毒效价。1.2.2MTT检测用96孔板接种细胞，待细胞贴壁伸展生长后，MV感染细胞，每个稀释度设6复孔，并设正常对照。感染后第1

5、～10天分别进行MTT检测。1.2.3琼脂糖凝胶电泳按DNA提取试剂盒说明书提取经病毒感染12d（根据预实验结果）的JEC细胞DNA，进行2%琼脂糖凝胶电泳，条件为60V，4h，然后使用凝胶成像分析系统检测电泳结果并拍照。1.2.4流式细胞术于病毒感染后一定时间收集细胞，按Annexin-VFITC/PI试剂盒说明书进行操作，制备样品，上机检测细胞凋亡率。1.2.5免疫细胞化学法检测细胞凋亡机理收集MV感染后12d的细胞，进行石蜡包埋、切片，进行切片的免疫组化实验，观察细胞Fas、FasL以及TGF-的表达

6、变化，进行吸光度值的比较。设阴性对照、正常对照、病毒组。1.3统计学处理采用SPSS12.0软件对所得数据进行统计分析，两变量的相关性以相关系数（r）值确定，计量资料用（xs）表示，比较采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1病毒TCID50病毒TCID50的稀释度为1：160，本研究拟采用1：80、1：40、1：20、1：10四个稀释度作为感染浓度。2.2MTT检测抑制率=1-（病毒组OD/正常对照组OD），见表1。每个稀释度设6复孔，同一感染浓度条件下，病毒感染时间与抑制率呈正相关（P0

7、.01）。感染后6d内，病毒对细胞的生长表现为促进作用；而6d后，开始出现抑制作用，同一感染浓度，各浓度组不同感染天数的组间均存在着差异（P0.05或P0.01），9、10d抑制率与感染浓度呈正相关2.3凋亡特征性DNALadder条带的形成在1：10、1：20、1：40稀释度出现了凋亡特征性的Ladder条带，而对照组无明显的DNALadder条带的出现，见图1。图1MV感染后JEC细胞DNA电泳结果注：M：marker；1：阴性对照；2～4：1：10、1：20、1：40稀释度感染12d2.4流式细胞仪检

8、测JEC凋亡率的结果每个稀释度设3复瓶培养，同一感染浓度条件下，随感染时间的延长，细胞凋亡率逐渐上升，两者为正相关。同一时间点与对照组比较，病毒组的细胞凋亡率升高（P0.05或P0.01），感染后12d，感染浓度与凋亡率呈正相关，见表2。2.5免疫细胞化学法检测JEC细胞Fas、FasL以及TGF-表达结果2.5.1Fas的表达镜下Fas阳性染色主要位于细胞浆中，每组取8个不同视野进行光密度值测定，与正常对照组相