蛋白质定量的五种方法

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1、蛋白质定量的五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。[原理]双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-

2、CS-NH2等基团也有此反应。[操作]取中试管7支，按下表操作。各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。[计算](一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。(二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。[器材]中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。[试剂](—)6NNaOH：称取240g氢

3、氧化钠溶于1000ml水中。(二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O3.0克，酒石酸钾9.0克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6NNaOHl00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。(三)0.9％NaCl。(四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。(五)待测血清样本：将人血清或

4、动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。方案二Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度[目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。[原理]蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。[操作]取试管7支、编号、按下表操作：生理盐水生理盐水立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。操作注意事项：1．按顺序添加试剂2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲

5、）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。[计算](一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。[器材](一)721型分光光度计(--)恒温水浴箱(三)中试管7支(四)刻度吸管：1.0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。[试剂](一)试剂甲(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液(2)0.2N氢氧化钠溶液(3)1％硫

6、酸铜溶液(CuSO4·5H2O)(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。(一)试剂乙：(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。(2)或取Na2WoO42H2Ol00g和Na2MOO325g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO450ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水

7、50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。(三)标准蛋白质溶液用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。方案三紫外分光光度法测定蛋白质浓度[目的]：掌握紫外分光光度法

8、测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。[原理]蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长