蛋白质定量检测方法

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1、Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ）BradfordAssayisarapidandaccuratemethodcommonlyusedtodeterminethetotalproteinconcentrationofasample.TheassayisbasedontheobservationthattheabsorbancemaximumforanacidicsolutionofCoomassieBrilliantBlueG-250shiftsfrom465nmto595nmwhe

2、nbindingtoproteinoccurs.Bothhydrophobicandionicinteractionsstabilizetheanionicformofthedye,causingavisiblecolorchange.Withinthelinearrangeoftheassay(~5-25mcg/mL),themoreproteinpresent,themoreCoomassiebinds.ReferenceBradford,M.Arapidandsensitivemethodforthequantitat

3、ionofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.(1976)72,248-254.考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低

4、检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。操作一、标准方法取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1

5、mL双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。二、微量蛋白分析法取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。试剂配制：1.标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL的溶液。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数A1%1cm=6.6来确定

6、。2.蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(W/V)磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇，和8.5%(W/V)磷酸。Folin-酚法Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理　　这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚

7、试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。　　Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物

8、质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）