橡胶树aflp体系的探讨

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1、橡胶树AFLP体系的探讨【摘要】以197个橡胶树杂交群体样本为材料，通过对影响AFLP技术的多种关键因素进行研究，建立了一套适合橡胶树的AFLP技术优化体系。其中优化的关键的因素为：(1)酶切-连接时DNA模板为250ng，反应体系采用各3UEcoRI/MseI/T4连接酶。反应时间为10h；(2)预扩增模板为稀释一倍的酶切连接产物，用量为1μL；(3)选择性扩增要用稀释倍数为40倍的预扩增产物。本研究为橡胶树遗传图谱的构建及育种的辅助选择提供有力的工具。　　【关键词】橡胶树;限制性内切酶;AFLP;银染　　AFL

2、P[1]技术，又称扩增片断长度多态性，是基于RFLP和PCR相结合的DNA分析技术。AFLP多态性强，非常适合遗传多样性分析[2]、快速遗传图谱构建等研究。橡胶树是多年生的高大乔木，普通育种期一般要经过8年的时间，常规育种的选育和改良品种技术对于橡胶树的更新换代是很难突破，现代分子生物学技术的出现，尤其是近代DNA基因改良技术的出现，加快育种目标的实现成为可能。用AFLP分子标记技术为橡胶树高产育种提供相应的分子辅助手段。但操作技术要求上高于其他方法由于该技术实验步骤比较繁杂，有许多因素会直接影响AFLP分析的效果

3、。为了加快对橡胶树的研究，现代分子生物学也进入橡胶树育种的领域。为了使更好地把分子生物学应用在品种鉴别及辅助育种等工作上，建立起一套适合于橡胶树基因组AFLP标记分析的技术体系对于开展橡胶树遗传图谱的研究有着实践意义，为使AFLP研究分析结果更可靠、更准确，对橡胶树基因组AFLP分析的DNA模板构建和银染技术体系分别进行了分析和改良，进而使适合于橡胶树AFLP的研究体系更加完善。　　１．仪器与材料　　仪器:恒温水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、垂直电泳槽。　　材料：橡胶树杂交群体样本群体（（873×GT1）样品、E

4、coRIMseI接头、引物、Tag酶、EcoRI内切酶MseI内切酶T4-DNA连接酶及dNTP。　　2.AFLP体系分析　　2.1酶切连接体系DNA模板制备　　采用EcoRI、MseI双酶切组合，DNA模板片断与引物接头的连接。每个DNA模板样品酶切连接反应体系中混合液总体积约为20μL。如图(1)各成份加入后混匀，在恒温水浴锅37℃酶切连接12h过夜。取6μL酶切产物在琼脂糖凝胶（2%）检测结果。　　Table1完善酶切连接体系Table2完善预扩增体系　　2.2预扩增体系　　将连接完成后的DNA样品用0

5、.1×TE稀释1倍后，进行预扩增。预扩增的反应体系为20μL,加入如图(2)所示10×buffer和酶切连接稀释后的DNA产物,MSeI引物(M00)和EcoRI引物(E00),Taq酶。各成份加入混合后在BIOMITRA-T1热循环仪上进行。热循环参数设置为:　　(1)94℃3min-(2)94℃30sec-(3)56℃40sec-(4)72℃80sec（gotostep2-30cycles）-(5)72℃5min　　整个循环为３０，扩增生成物在琼脂糖凝胶（2%）跑电泳，然后检测结果。　　2.3选择性扩增　　用稀

6、释20倍的0.1×TE用于对预扩增产物进行选择性扩增,用于选择性扩增的体系为20μL,选择扩增引物dNTP、10×PCRbutter,DNAMSeI/EcoRITaq酶以及预扩增稀释后的产物。混匀放入热循环仪上进行扩增。热循环仪器上的参数设置为：　　(1)94℃3min-(2)94℃30sec-(3)65℃40sec（-1℃/cycle）-(4)72℃80sec(gotostep210cycles）-(5)94℃30sec-(7)56℃30sec-(8)72℃75sec（goto523cycles）-(9)72℃5

7、min　　Table3选择性扩增产物　　产物4℃冰箱保存备用。　　3.选择性扩增产物的检测　　在清洗玻璃板后紧接灌胶，然后上样后电泳。等电泳完后进行银染检测。检测步骤为脱色、染色、显影、终止显影，最后使胶板干燥。将显影后的胶板置于室温下，自然干燥，干燥后用计算机图像扫描仪扫描或数码相机拍照保存图片。　　4.结果与讨论　　在AFLP分析中采用MseI和EcoRI对基因组DNA进行双酶切,采用筛选出的引物组合MseC和EcoRA进行预扩增对于选择性扩增则采用EcoRANN和/MseN带三个选择性碱基引物组合，选用合适的

8、引物,快速银染法进行染色，经过电泳后，每个泳道中可以得到20-90条清晰的条带，说明Mse和EcoR双酶切组合以及完善的各步骤对于橡胶树基因组进行AFLP体系扩增是比较好的。　　对AFLP分析的准确度关键是在酶切的选择，基因组比较大，同时GC含量又低，这样橡胶树基因组的适宜选择识别位点应该富含AT的内切酶组合。这样对橡胶树基因组DNA酶切才能达到好的效果，预