柱花草aflp反应体系的建立与引物筛选

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1、2014年4月热带农业科学第34卷第4期Apr．2014CHINESEJOURNALOFTROPICALAGRICULTUREVol．34,No．4柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选①韩蓉蓉1,2)②曾黎琼2)史亮涛3)刘国道4)何光熊3)文亦芾1)③金杰3)(1云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201；2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室云南昆明650223；3云南省农业科学院热区生态农业研究所云南元谋651300；4中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南儋州571737)摘要以柱花草

2、奥克雷品种为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化，建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明：20μL为最佳反应体系，酶切体系中DNA模板量为1000ng，用5UEcoRI37℃酶切2h、5UMseI65℃酶切2h效果最佳；分别取5μL酶切液、1μLT4连接酶(5μL/L)、1μLEcoRI接头、1μLMseI接头、2μL缓冲液(T4DNA酶自带)，于22℃下连接10min效果最佳；预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75mmol/L、Taq酶用量为1U、dNTPs浓度为0.2mmol/L、引物浓度为2ng/μL效果最佳；选择

3、扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25mmol/L、Taq酶为1U、dNTPs浓度为0.225mmol/L、引物浓度为0.4ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选，筛选出46对引物组合，为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。关键词柱花草；DNA；AFLP；引物筛选分类号S541EstablishmentofAFLPReactionSysteminStylosanthesguianensiasandItsPrimerSelection1,2)2)3)HANRongrongZENGLiqiongSHILiangtao4)

4、3)1)3)LIUGuodaoHEGuangxiongWENYifeiJINJie(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201；2BiotechnologyandGeneticGermplasmInstitute/YunnanProvincialKeyLabofAgriculturalBiotechnology/MinistryofAgricultureKeyLabofSouthwesternCropGeneResourceandGermplasmInno

5、vation，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming，Yunnan650223；3ResearchInstituteofTropicalEco-agricultureSciences，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Yuanmou，Yunnan651300；4TropicalCropGeneticResourcesInstitute，CATAS，Danzhou，Hainan571737)AbstractExtractthetotalDNAofStylosanthesguianensisusinga

6、nimprovedmethodofCTAB.TheStylosanthesguianensisAFLPsystemwasestablishedanditsprimerswereselectedforanalysisbyoptimizingthemainfactorsaffectingtheAFLPsystem.TheresultsindicatethattheAFLPoptimumconditionsforrestrictionenzymedigestionoftheStylosanthesguianensiswereasfollows:1000ngDNA①基金项目：国家自然科学基金

7、(No.30960266；No.31160481)；农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金(No.KFKT：201011)。收稿日期：2014-03-05；责任编辑/林海妹；编辑部E-mail:rdnk@163.com。②韩蓉蓉(1988～)，女，硕士研究生，主要研究方向为草地(草坪)与环境；E-mail:19891214rong@163.com。③通讯作者。E-mail:yifeiw2005@yahoo.com.cn。-46-韩蓉蓉等柱花草AF