nucb22fnesfatin-1对小鼠摄食行为的调控及机制

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1、青岛大学硕士学位论文的另外一组神经元则能表达和分泌抑食因子前黑素细胞皮质素原（POMC）和CART。研究发现，禁食24h的大鼠，PVN(室旁核)NUCB2/nesfatin-1mRNA表达显著降低[1]。侧脑室、第三或第四脑室注射nesfatin-1，均可引起大鼠夜间进食量的减少[12,13]。但nesfatin-1对进食行为的改变机制仍不清楚。有研究表明，大鼠禁食24h后胃NUCB2mRNA和血浆NUCB2/nesfatin-1水平均显著降低[14]，提示外周nesfatin-1可能有潜在调控进食作

2、用。目前仅有一项研究显示，腹腔注射nesfatin-1后可减少小鼠夜间进食[15]，而大鼠无此作用[14]。因此，本研究将对自由进食的小鼠侧脑室、腹腔或皮下注射nesfatin-1，观察比较不同部位注射nesfatin-1对小鼠夜间摄食及摄食行为的影响，探讨nesfatin-1对小鼠摄食行为的影响及机制。2万方数据材料与方法第一章材料与方法1.1主要实验材料：1.1.1实验动物成年雄性昆明小鼠48只，将小鼠置于特定温度(25±2)℃，环境安静，24小时昼夜循环光照条件下生活，自由进食和水。所有动物实验

3、均符合―青岛大学实验动物保护和使用管理办法‖。1.1.2主要实验仪器（1）脑立体定位仪STW-3型，成都仪器厂（2）冰冻切片机德国SLEE（3）微量电子天平MettlerAE100（4）离心机LD4-2A型，北京雷勃尔离心机有限公司（5）超低温冰箱DW-86L388型，海尔集团（6）显微镜FUM-850型，FUHO公司（7）磁力搅拌器上海南汇电讯器材厂（8）微量进样器Eppendorf公司（9）自制铜芯套管1.1.3主要实验试剂（1）nesfatin-1抗体（1:200）美国Phoenix公司（2）生

4、物素羊抗兔IgG美国Phoenix公司（3）硫酸仲丁巴比妥国药集团化学试剂有限公司产品（4）4%多聚甲醛国药集团化学试剂有限公司产品（5）10%蔗糖国药集团化学试剂有限公司产品（6）PBS缓冲液国药集团化学试剂有限公司产品（7）DAB国药集团化学试剂有限公司产品（8）乙醇国药集团化学试剂有限公司产品（9）二甲苯国药集团化学试剂有限公司产品（10）兔血清美国sigma公司3万方数据青岛大学硕士学位论文1.1试剂配制（1）多聚甲醛：0.1M，PH=7.4的PBS配制成浓度为4％的溶液，用于动物组织灌注固定

5、。（2）0.01M磷酸缓冲液（PBS）(pH7.2-7.4)Na2HPO4•12H2O2.9gNaH2PO4•2H2O0.3gNaCl8.8g加双蒸水定容至1000ml4˚C保存备用。(3)0.1M磷酸缓冲液（PBS）(pH7.2-7.4)Na2HPO4•12H2O29gNaH2PO4•2H2O3gNaCl8.8g加双蒸水定容至1000ml4˚C保存备用1.1.1主要实验方法：1.2.1动物分组成年雄性昆明小鼠（6-8周龄）48只，随机分为NS对照组（16只）和实验组（32只）。小鼠在特定温度(25±

6、2)℃，24小时昼夜循环光照条件下生活，自由进食和水。1.2.2侧脑室埋管经腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉小鼠，麻醉后将小鼠固定于脑立体定位仪，头部去毛，酒精消毒，纵向剪开小鼠头皮，过氧化氢擦拭，暴露颅骨，参照小鼠脑立体定位图谱，定位右侧脑室，牙科钻钻孔，将自制铜芯套管植入右侧脑牙托粉固定。术后5天进行实验。1.2.3进食实验32只小鼠（每组8只）侧脑室分别注射1μlnesfatin-1（0.3μg、1μg、3μg）或1μlNS，随之观察24h进食量。另取小鼠16只，分别腹腔注

7、射100μlnesfatin-1(70μg)或100μlNS，随之监测24h进食量。进食量=实验前食物量-实验后食物量1.2.4免疫组化染色小鼠经腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉，4%多聚甲醛经心灌注，取脑、后固定。将脑置于10%蔗糖24h，冰冻切片机切片。切片经含nesfatin-14万方数据材料与方法抗体（1:200，美国Phoenix公司）的孵育液中孵育过夜（4°C），PBS缓冲液洗涤后，切片用生物素羊抗兔IgG（1：500，美国Phoenix公司）室温孵育1h，DAB显色

8、。切片经梯度乙醇和二甲苯脱水，封片。光镜下观察结果。对照组以正常兔血清代替一抗，其他步骤同上。1.3统计学分析—所有数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS17.0软件分析，两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。5万方数据结果第二章结果1.1侧脑室注射nesfatin-1对小鼠摄食的影响与NS对照组相比，侧脑室注射不同剂量nesfatin-1(1μg，3μg)，小鼠注药后前4h的夜间进食量明显减少，