玉米黄质环氧化酶基因转基因rna干涉

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1、玉米黄质环氧化酶基因转基因RNA干涉1.文献综述1.1玉米黄质目前饲料中使用的玉米黄质通常是天然产物，主要来自于黄玉米。然而从玉米中玉米黄质的含量来看，直接从玉米种制备玉米黄质在大规模工业生产中还是有一定困难的。但是随着近年来技术的发展，加工规模越来越大，所以作为玉米加工副产物的玉米黄质的产量现在变得可观，而且资源集中。这种资源在今后相当长的一段时间内可以被认为是玉米黄质天然产物制备的理想资源。玉米是世界上最重要的农作物之一，其种植面积总产量仅次于水稻、小麦居于世界第三，平均单产量则居首位，全世界约有三分之一的人以玉米籽粒为主食。而我国也是玉米种植的

2、大国，特别是气温和光照较高的西南地区，玉米是最主要的农作物之一。高等植物中，玉米黄质是内胡萝卜素到堇菜黄素（Violaxanthin)合成的一个中间产物（图2)。植物玉米黄质的合成首先开始于的栊牛儿犓牛儿基焦磷酸（GGPP)到八氢番燕红素（PHY)，此过程是由八氧番痴红素脱氢酶催化（PSY)气接着八氧番燕红素在八氧番痴红素脱氢酶（PDS)作用下生成纟-胡萝卜素[6，7]。然后纟-胡萝卜素在t胡萝卜素脱氢酶（ZDS)作用下连续脱梭生成番煎红素（LYC)，途中生成了链孢红素_。番前红素这时可以形成两条生物途径，一条是在番前红素通过番前红素S-环化酶(Ly

3、copenee-cyclase,LCYe)和痴红素P-环化酶（LycopeneP-cyclase,LCYb)作用下合成5-胡萝卜素和CX-胡萝卜素。最后ct-胡萝卜素在胡萝卜素羟化酶（s-carotenehydroxylase.Hye)合成叶黄素。1.2RNA干扰1995年，Kemphues和Eenglish通过研究植物病毒感染后恢复的机制提出了基因共抑制是植物体用于抗病毒感染的免疫机制[43]。GoodRNA的降解，从而实现了价廉而实用的基因敲出，这项技术不仅在2001年、2002年两次夺得十大科技进步的赞誉。siRNA分子更被评为2002年度分子

4、。2002年5月一整期的《科学》杂志用于发表RNA干扰的综述文章。2003年RNA干扰技术再次被《科学》杂志评为2003年全球科学进展第四位：任然是热点。2材料和方法2.1玉米黄质环氧化酶基因Zep的克隆RNA提取试剂的配制：(1)0.1%焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate,DEPC)处理水制备：DEPC与去离子水按比例混合成0.1%浓度，常温下过夜，12rC高温湿热灭菌40min。(2)75%乙醇（V/V)：取75mL无水乙醇加0.1%DEPC处理水定容至lOOmL，4Cje存备用。(3)5mol/LNaCl：称取292.5gN

5、aCl用900mL的0.1%DEPC水充分溶解，再定容到1L，121°C高温湿热灭菌40min。提取前处理：选取幼嫩的玉米叶片，用去离子水冲洗干净，置于滤纸上自然风干处理2h。RNA操作中的器皿用0.1%DEPC溶液浸泡过夜，高温高压灭菌后烘干待用。(1)取新鲜幼嫩的玉米叶片放入液氮预冷过的研钵，迅速加入液氮，将研磨成粉的样品迅速按每管0.5g分装到10mL离心管中，(2)每管分别加入5mLTrizol,剧烈振荡后，室温放置10min。(3)4。C，12000r/min离心5min，吸出上清液转入另一干净的离心管中。(4)向每管加入0.1mL

6、5mol/L的NaCl,混合均匀，再向每管加入1mL氯仿，剧烈振荡15s后，室温放置3rnin，4°C，12000Xg离心15min，在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的10mL离心管中。(5)向每管中加入等体积的异丙醇，混勾后，室温放置8-lOmin，(6)4°C，12000r/min离心D19-T质粒和pSKintron质粒DNA进行酶切。采用20

7、iL酶切体系（表4,5),37°C水浴中反应4h。限制性内切酶购自生物公司。轻微混勻后，于16'C水浴连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a，用Hi

8、ndIII和BamHI对重组子同时进行双酶切鉴定，检测正确的重组质粒命名为pSK-ZmZEl。片段ZmZE2的插入通过使用限制性内切酶SacI和EcoRI对和pSK-ZmZEl质粒DNA和ZmZE2-PMD19-T片段同时进行双酶切，分别同时回收载体大片段和ZmZE2，然后进行连接。连接体系（表7)。16°C水浴连接过夜，然后转化大肠杆菌，用SacI和EcoRI同时进行双酶切鉴定，酶切产物即为本试验的中间载体ZepRNi-PSK。首先用SacI和BamHI分别双酶切中间载体ZepRNi-PSK和pTFlOl.lM,然后分别回收中间载体的小片段

9、和pTFlOl.lM的大片段，最后用T4DNA连接酶连接两个回收片段（16°C水浴连接过夜)，构建成