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1、口蹄疫疫苗制备工艺猪口蹄疫是由口蹄疫病毒（FootandMouthDiseaseVirus，FMDV）引起的猪等偶蹄动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。该病早在14世纪的意大利学者第1次描述了FMDV。1898年，Loeffler和Frosch等证明了口蹄疫的病原体为滤过性病毒。本病广泛分布于世界各地，目前除有少数国家已经扑灭本病外，至今仍有70多个国家还时有发生。该病的发病率几乎达100%，但病程一般呈良性经过，死亡率只有2%～3%，仔猪呈恶性病型，死亡率可达50%～70%，该病除导致猪死亡造成直接经济损失外，最为严重的是由于其传染性极强和引起大规模流行，并影响一个国
2、家的畜产品进出口贸易，造成巨大经济损失和政治影响，所以国际兽疫局将该病列为A类家畜传染病之首，并列入世界范围内重要传染病研究行列。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7—8纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型cA、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。据观察，一个地区的牛群经过有效的口蹄疫疫苗注射之后，1—2月内又会流行，这往往怀疑是另一型或亚型病毒所致。这是因为该病毒易发生变异。该病毒对外界环境的抵抗力很强，在
3、冰冻情况下，血液及粪便中的病毒可存活120—170天。阳光直射下60分钟即可杀死；加温85℃15分钟、煮沸3分钟即可死亡。对酸碱之作用敏感，故1%一2%氢氧化钠、30%热草木灰、1%一2%甲醛等都是良好的消毒液。1．材料1．1主要设备生物反应器、细胞计数仪。1．2BHK21细胞悬浮适应株1．3口蹄疫种毒OJMS／2000株为现行牛口蹄疫双价疫苗制苗毒株，每0．2mL含有的LD50为107.0，亚洲I型为Asia1／JSL／GSZY／06株，每0．2mL含有的LD50为107.51．4培养基细胞培养用培养基、病毒繁殖用细胞维持培养液、犊牛血清。1．5其他主要化学试剂消化液：EDTA-胰酶灭
4、活剂：二乙烯亚胺(BEI)阻断剂：硫代硫酸钠或焦亚硫酸钠溶液油佐剂1．6试验动物乳鼠2～4日龄吮小鼠，临床健康。2.方法2．1细胞培养BHK21细胞系是制备FMD疫苗所需病毒抗原的理想细胞系。采用转瓶培养培养BHK21细胞。转瓶培养是将种子细胞用消化液分散成单个细胞后加营养液震荡,使细胞分散于营养液中,再将此营养液按一定比例分装于若干圆柱形细胞瓶中,给细胞瓶加塞扎口后放置于转瓶机上37℃旋转培养,使营养液中的细胞附着于瓶壁,交替接触营养液而分裂增值。传统的消化液采用EDTA-胰酶。2.2病毒液制备选取培养2-3d、形态良好致密的单层BHK21细胞接入种毒,37摄氏度培养0.5h-2h使病
5、毒吸附于细胞后加入维持液继续培养,当细胞病变达90%(CPE)以上时,即可收取病毒液,病毒液经菌检及效检合格后方可进入下一环节。实践证明病毒液反复冻融使细胞破裂,充分释放包含的病毒粒子,可提高病毒效价。转瓶病毒培养属劳动密集型方法,较难控制污染且容易散毒,但生产的病毒液效价比较高。悬浮培养法增值病毒是当反应器中悬浮培养的细胞数达到3×107/mL时接毒,约20-30h后收毒,病毒液的TCID50可达7-8。2.3病毒纯化使用中空纤维超滤膜纯化浓缩FMDV抗原,原液通过射流泵,在一定的压力下呈湍流状态在中空纤维超滤膜内或外表分布流动,溶剂和小于截留分子量的物质透过膜的俗称透过液,而大于膜截
6、留分子量的胶质等被截留的俗称浓缩液,如要返回到原液中时,其原液的浓度会逐渐升高,此过程称为“浓缩”,如此反复,从而实现大小分子量的分离,浓缩和提纯的目的。2．4抗原灭活甲醛曾是FMDV疫苗生产中应用最为广泛的灭活剂,但经研究发现,病毒液中的水解乳蛋白等物质能抑制甲醛的灭活作用而导致灭活不彻底。上世纪80年代以来多数疫苗生产厂家改用乙烯亚胺类衍生物(aziridine)作为灭活剂,其中二乙烯亚胺(BEI)因毒性较小,现在被广泛使用。2000年世界动物卫生组织(OIE)向各国推荐使用1mmol/LBEI两次灭活法,即20-37℃灭活24h后再加一次BEI灭活24h,经多年应用效果较好。200
7、6年OIE又推荐了3mmol/LBEI两次灭活法,BEI用量增加到3mmol/L,26℃分两次共灭活48h,灭活剂用量加大使疫苗安全性更高,温度降低有利于保持病毒粒子146S完整性。研究表明乙烯亚胺类衍生物与甲醛相比,不仅毒性大而且灭活后病毒稳定性差,甲醛灭活的弗氏佐剂疫苗有效期可达10年,而BEI灭活的同类疫苗有效期仅2年左右。另有研究表明SAT2型FMDV经乙烯亚胺类衍生物灭活后再经甲醛处理,稳定性明显提高。甲醛与BEI协同作用
