谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定

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1、谷物种子蛋白质中赖氨酸含量的测定一、实验目的掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法,测定谷物种子蛋白质中赖氨酸含量。二、实验原理蛋白质中的赖氨酸具有一个游离的ε-NH2，它与茚三酮试剂反应生成蓝紫色物质，其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸的含量成线性关系。因此，用已知浓度的游离氨基酸制作标准曲线，通过比色分析（530nm）即可测定出样品中的赖氨酸含量。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，而且仅有—个游离氨基(ε-NH2)，所以通常用亮氨酸配制标准液。但由于这两种氨基酸分子质量不同，以亮氨酸为标准计算赖氨酸含量

2、时，应乘以校正系数1.1515，最后再减去样品中游离氨基酸含量。三、实验仪器1．电子分析天平（1/1000）、可见分光光度计、恒温水浴箱、干燥器、移液器。2．试管架（塑及铝）、具塞试管、具塞三角瓶、细口瓶、漏斗（或0.45um滤膜）、吸管等。四、实验试剂1．0.4mol/L柠檬酸缓冲液：称取4.202g柠檬酸和5.88g柠檬酸三钠，溶于100ml蒸馏水中。2．茚三酮试剂：称40mg二氯化锡(防腐)溶于25ml柠檬酸缓冲液中；称lg茚三酮溶于25ml95％乙醇中；将上述两液混合摇匀，滤去沉淀，上清液置冰箱中保

3、存备用。3．0.02mol/L盐酸：取12mol/L盐酸0.17ml，用蒸馏水稀释定容至100ml。4．亮氨酸标准液：准确称取20mg亮氨酸，加数滴0.02mol/L盐酸使之溶解，然后用蒸馏水稀释定容到100ml，则得浓度为200μg／ml的标准液。5．60％乙醇。6．4％碳酸钠：称取4g无水碳酸钠，溶于100ml蒸馏水。7．2％碳酸钠。五、操作步骤1．标准曲线的制作。取7支具塞试管，按表进行编号、加入试剂，顺序操作。以第1管为空白，在530nm波长下比色，读取吸光度值。并以吸光度值为纵坐标，亮氨酸含量（μ

4、g）为横坐标，绘制标准曲线。2．样品前处理不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过80～100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶中，加入沸程60～90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8小时，不时摇动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉凉在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器内，保存备用。3．样品的测定取15mg已粉碎脱脂的玉米样品于具塞干燥试管内，加2％碳酸钠1.0ml，于80℃水浴中提取20min，然后加茚三酮试剂2.Oml，继续保温显色30min，冷却后

5、加60％乙醇3.Oml，混匀后过滤或离心，然后在530nm波长下比色。六、实验结果样品中赖氨酸的含量（%）=[从标准曲线上查得值（μg）×10-3/(样品重mg)]×1.1515×100%-C校正系数：1.1515；C：游离的氨基酸含量七、注意事项1．各种作物种子中游离氨基酸含量是：玉米0.01％、小麦0.05％、水稻0.01％、高粮0.04％。2．茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色。标准曲线的制作及样品测定参考

6、表试管号#######试剂1(空白)234567(样品)亮氨酸标准液(ml)00.10.20.30.40.5／蒸馏水(ml)0.50.40.30.20.10／亮氨酸含量(μg)020406080100／4％碳酸钠(ml)0.50.50.50.50.50.5／脱脂样品(mg)／／／／／／152％碳酸钠(ml)／／／／／／1.0／／／／／／80℃水浴20分钟茚三酮试剂(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混匀，加塞，80℃水浴30分钟，冷却至室温60％乙醇(ml)3.03.03.03.03.03.0

7、3.0／／／／／／过滤混匀A530蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（DyeBindingLysine，DBL）测玉米种子中赖氨酸含量。一、茚三酮显色法原理：谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε-NH2，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，

8、配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量.二、材料、仪器设备（一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60～90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。（二）仪器设备：1.722型分光光度计