高效液相色谱法测定胀果甘草中甘草酸的含量

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1、高效液相色谱法测定胀果甘草中甘草酸的含量【关键词】甘草　　　甘草为豆科植物甘草(glycyrrhizauralensisfisch)、胀果甘草（glycyrrhizainflatabat）或光果甘草(glycyrrhizaglabral)的干燥根及根茎，始载于《本经》，药用历史悠久。其功能补脾益气、润肺止咳、缓急止痛、清热解毒、缓和药性。主要含有甘草酸及甘草苷类成分，其中甘草酸为现代药理应用研究证实具有抗纤维化、抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能等作用［１］。目前针对甘草的内在质量控制，主要围绕甘草

2、酸成分进行定性、定量一类的检查。2005版《中国药典》收载了RP-HPLC三元等度洗脱法测定甘草酸的方法，规定甘草酸含量不得低于2%［２］。本实验依托2005版《中国药典》一部甘草酸含量测定（附录VID）项下操作主线，采用RP-HPLC法测定甘草酸的含量，方法简便、快速，重现性好，结果稳定，用于甘草酸的检测专属性强，　　1仪器与试剂　　1.1仪器　　Agilend1100系列液相色谱仪、四元泵、在线真空脱气、DAD检测器、化学工作站、1200型自动进样器。　　1.2试剂　　甘草酸单铵盐（monoam0

3、niumglycyrrhitinate）对照品（中国药品生物制品检定所）；甘草(glycyrrhizainflatabat)样品，产地新疆（华东医药股份有限公司）；甲醇（色谱纯）、醋酸铵（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、水（双蒸水）。　　2实验方法与结果　　2.1色谱条件　　美国ZORBAXExundC18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）为固定相；甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1）为流动相；检测波长250nm；流速1ml·min-1；柱温为室温。柱效以甘草酸计，理论塔板数不

4、应低于2000。结果被测成分于7min内即可出完，三元等度洗脱全程为0～20min。记录的色谱图结果见图1，2。　　　2.2对照品溶液的制备　　精密称取80℃干燥至恒重的甘草酸单铵盐0.1g对照品，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，使成每ml含有甘草酸单铵盐1mg对照品溶液。　　2.3供试品溶液的制备　　取甘草，研细（过3号筛），置烘箱内80℃干燥至恒重，精密称取0.3g，置100ml量瓶中，加流动相约45ml，超声处理（功率250in，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.4

5、5μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。　　2.4测定方法　　精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液色谱图中甘草酸的峰面积（3次平均）外标法计算甘草中甘草酸的含量（%，l于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，分别进样10μl，记录峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。甘草酸回归方程为Y=3.00029X+1.23099r=0.99989，线性范围0.1033～1.0330μg。　　2.8重现性试验　　取同一批次

6、甘草药材按2.3项下提取制备5份供试溶液，分别精密吸取10μl进样，记录峰面积，结果甘草酸RSD=1.32%。　　2.9回收率测定　　取已知含量的甘草样品粉末约0.2g，精密称定9份，置10ml的量瓶中，样本中添加1mg/ml甘草酸对照品溶液1ml，按2.3项下操作，进样10μl，依2.4法测定,记录峰面积并计算回收率，甘草酸平均回收率为99.04%RSD=0.79%，结果见表1。表1甘草酸加样回收率实验结果（略）　　2.10样品测定　　取6批样品，按2.3项下提取制备，依2.4项方法测定，重复测定3

7、次，结果生药甘草的平均含量为7.85%RSD=0.85%。　　3讨论　　3.1洗脱溶剂系统的选择　　本实验为RP-HPLC三元等度洗脱法。选择甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67：33：1）作为洗脱溶剂，是基于甘草酸对三元等度洗脱系统的适应性的考量。胀果甘草中含有甘草酸、甘草苷等成分，因此只要选择适宜的洗脱溶剂系统，以促使各组分的分配系数较大，达到基线分离的效果。实验证明该方法简单、易行，设备要求相较梯度洗脱为低，早期一类设备都可用于检测，且抗干扰性强，具有专属性特点。　　3.2关于甘草酸　

8、　由生药甘草中提取的甘草酸，通常称之天然甘草酸，天然甘草酸存在顺反异构，且以顺式甘草酸含量为高，反式甘草酸含量极低。本实验未能揭示该异构体基线分离，可能与该异构体化学结构相似抑或是胀果甘草本身未含有反式甘草酸有关，尚待进一步研究。【参考文献】　　1张剑峰，张丹参.甘草酸药理作用的研究进展.河北北方学院学报（医学版），2005，22(4):82.　　2国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2005.60.