益气养阴方对肺间质纤维化大鼠模型tnfatgfβ1i

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1、益气养阴方对肺间质纤维化大鼠模型TNFaTGFβ1I清洁级健康雄性SD大白鼠60只,体重为(240±10)g,纯白色,由湖北省动物实验中心提供,合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。实验前7天将购入的60只健康雄性SD大鼠适应性喂养于实验环境中,室温保持在20℃一25℃。然后将其随机分为正常组、模型组、中药组、激素组、中药+激素组5组,每组各12只。手术前一天,对大鼠颈部行脱毛及备皮处理。手术开始后,首先将大鼠用配制好的3.5%水合氯醛(lOml/kg)麻醉后仰卧固定于35度倾斜手术板上,使大鼠咽喉部皮肤暴露在光源下,切开颈部

2、皮肤,用血管钳钝性分离出气管,用1ml注射器在环状软骨间刺入气管腔,回抽,有气体则缓慢注入BLMA5(5mg/kg),注射完毕后迅速将手术板竖立并旋转,使药物尽可能均匀分布在大鼠肺内,然后逐层缝合肌层及皮肤,消毒。术毕,予以注射青霉素(8万u/天,持续注射3天)预防感染,待动物清醒后自由进食。另外正常组大鼠,气管内注入的为等体积生理盐水,其它操作同上述造模法。造模后第28天,开始灌胃给药,连续给药28天,给药剂量由成人每日常规服药量换算而成。①正常组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；②模型组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；③中药组

3、：配制好的中药予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；④激素组：将配制好的浓度为35%的醋酸泼尼松溶液予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；⑤中药+激素组：将配制好的中药+激素混合溶液予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；以上各组大鼠均置于相同实验环境下饲养,室温保持在20℃一25℃,自由进食,饮水,于灌胃后第14、28天分批处死。配制好的3.5%水合氯醛溶液(现配)腹腔注射麻醉大鼠,断头处死,固定在手术板上,暴露胸腔,切开皮肤,逐层分离肌层,剪断肋骨,完整分离出肺组织。取左肺下叶一部分组织浸泡在准备好的10%中性甲醛溶液

4、中,常规脱水、浸蜡、包埋,切片后进行HE染色及Masson染色观察肺组织形态学改变。同时取右肺底一部分组织置入DEPC水处理后的4%多聚甲醛溶液中及时固定,常规脱水、浸蜡、包埋,切片后行原位杂交法检测肺组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达。观察并记录各组大鼠饮食、饮水、皮毛、精神状况、二便、体重以及死亡情况等。(1)肺组织形态学观察1)肉眼观察各组大鼠肺组织外观形态断头处死大鼠后,肉眼观察分离出的完整肺组织外观形态。2)肺病理组织学观察将固定好的大鼠左肺下叶行HE染色及Masson染色观察肺组织形态学改变。HE染色法：①

5、取材,不能太大太厚,最好为24×24×2mm；②包埋；③切片,厚度5～10um间,厚薄均匀,无皱褶无刀痕；④石蜡切片经常规脱蜡至水；⑤水洗；⑥染苏木素3－5分钟；⑦分化；⑧于碱水中返蓝20秒左右；⑨伊红染色10－20秒；⑩脱水,透明,中性树胶封固,镜检。Masson染色法：①石蜡切片脱腊；②梯度入水：95%、70%、30%乙醇各漂洗2分钟,蒸馏水2分钟；③温热水漂洗：于30-40℃温热水中漂洗,每次30-60秒,一共2次；④于蒸馏水润湿玻片30-60秒；⑤R1核染液染色1分钟左右,倒丢,冲洗液冲洗30秒左右；⑥R2浆染液染色1分钟秒

6、左右,倒丢,冲洗液冲洗30秒左右；(R2染色时间不宜太长否则可导致胞浆着色过深,使R3褪色效果不佳)⑦R3黄色分色液分色6-8分钟左右(于镜下观察标本中胶原纤维部分褪色成淡粉红色为宜。如果褪色效果不佳,可适当调整分色时间,以便让胶原纤维更易着色)。弃去分色液。(无需冲洗)⑧用R4蓝色复染液复染5分钟左右,倒丢,然后用无水乙醇冲洗。⑨吹干,封片,镜检。(2)原位杂交法检测肺组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达将固定在配制而成的固定液{4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.0-7.6),含有1/1000DEPC}中的右肺组织

7、固定完毕后按下述步骤进行处理：①常规脱水、浸蜡、包埋。冰冻后切片,切片厚度6-8μm；②玻片的处理：玻片(包括盖玻片和载玻片)应用热肥皂水冲洗,再用蒸馏水冲洗,洗净后,置于清洁液中浸泡24h,然后蒸馏水洗净烘干,用95%酒精浸泡24h后蒸馏水冲洗,用烘箱烘干(温度最好在150℃及以上,过夜以便除去RNA酶)；③石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤3次；④暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加配制好的3%柠檬酸新鲜稀释后的胃蛋白酶(由1ml3%柠檬酸和2滴浓缩型胃蛋白酶混

8、匀而成),在37℃或室温下消化30分钟左右。原位杂交用PBS洗涤3次×5分钟。然后蒸馏水洗1次；⑤后固定：此为关键步骤,待胃蛋白酶消化好后再用配制而成的固定液{1%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEP