新城疫病原分离与鉴定【精品-doc】

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1、附件1新城疫病原分离与鉴定当临床诊断有新城疫发生时，应从发病禽或死亡禽采集病料，进行病原分离、鉴定和毒力测定。1样品的采集、保存及运输1.1样品采集1.1.1采集原则。采集样品时，必须严格按照无菌程序操作。采自于不同发病禽或死亡禽的病料应分别保存和标记。每群至少采集5只发病禽或死亡禽的样品。1.1.2样品内容发病禽：采集气管拭子和泄殖腔拭子（或粪便）；死亡禽：以脑为主；也可采集脾、肺、气囊等组织。1.2样品保存1.2.1样品置于样品保存液（0.01MPBS溶液，含抗生素且pH为7.0～7.4）中，抗生素视样品种类和情况而定。对组织和气管拭子保存液应含青霉素

2、（1000IU/mL）、链霉素（1mg/mL），或卡那霉素（50μg/mL）、制霉菌素（1000IU/mL）；对泄殖腔拭子(或粪便)保存液的抗菌素浓度应提高5倍。1.2.2采集的样品应尽快处理，如果没有处理条件，样品可在4℃保存4天；若超过4天，需置-20℃保存。1.3样品运输所有样品必须置于密闭容器，并贴有详细标签，以最快捷的方式送检（如：航空快递等）。如果在24小时内无法送达，则应用干冰致冷送检。1.4样品采集、保存及运输按照《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》（农业部公告第503号）执行。2病毒分离与鉴定2.1病毒分离与鉴定：按照

3、GB16550附录A3.3、A4.1、A4.2进行。2.2病原毒力测定2.2.1最小病毒致死量引起鸡胚死亡平均时间(MDT)测定试验按照GB16550附录A4.3进行；依据MDT可将NDV分离株分为强毒力型（死亡时间≤60小时）；中等毒力型（60小时＜死亡时间≤90小时；温和型（死亡时间＞90小时）。2.2.2脑内致病指数(ICPI)测定试验收获接种过病毒的SPF鸡胚的尿囊液，测定其血凝价>24，将含毒尿囊液用等渗灭菌生理盐水作10倍稀释(切忌使用抗生素)，将此稀释病毒液以0.05mL/羽脑内接种出壳24～40小时的SPF雏鸡10只,2只同样雏鸡0.05m

4、L/羽接种稀释液作对照(对照鸡不应发病，也不计入试验鸡)。每24小时观察一次，共观察8天。每次观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死鸡记为2（死亡鸡在其死后的每日观察结果都记为2）。ICPI值=每只鸡在8天内所有分值之和／(10只鸡×8天)，如指数为2.0，说明所有鸡24小时内死亡；指数为0.0，说明8天观察期内没有鸡表现临床症状。当ICPI达到0.7或0.7以上者可判为新城疫中强毒感染。2.2.3F蛋白裂解位点序列测定试验NDV糖蛋白的裂解活性是决定NDV病原性的基本条件,F基因裂解位点的核苷酸序列分析,发现在112～117位点处,强毒株为112A

5、rg-Arg-Gln-Lys(或Arg)-Arg-PHe117;弱毒株为112Gly-Arg(或Lys)-Gln-Gly-Arg-Leu117这是NDV致病的分子基础。个别鸽源变异株（PPMV-1）112Gly-Arg-Gln-Lys-Arg-PHe117,但ICPI值却较高。因此，在115、116位为一对碱性氨基酸和117位为苯丙氨酸（PHe）和113位为碱性氨基酸是强毒株特有结构。根据对NDVF基因112-117位的核苷酸序列即可判定其是否为强毒株。(Arg-精氨酸；Gly-甘氨酸；Gln-谷氨酰胺；Leu-亮氨酸；Lys-赖氨酸)。分离毒株F1蛋白N

6、末端117位为苯丙氨酸（F），F2蛋白C末端有多个碱性氨基酸的可判为新城疫感染。“多个碱性氨基酸”是指113至116位至少有3个精氨酸或赖氨酸（氨基酸残基是从后F0蛋白基因的N末端开始计数的，113至116对应于裂解位点的-4至-1位）。2.2.4静脉致病指数(IVPI)测定试验收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液，测定其血凝价>24，将含毒尿囊液用等渗灭菌生理盐水作10倍稀释(切忌使用抗生素)，将此稀释病毒液以0.1mL/羽静脉接种10只6周龄的SPF鸡，2只同样鸡只接种0.1mL稀释液作对照(对照鸡不应发病，也不计入试验鸡)。每24小时观察一次，共观

7、察10天。每次观察后给试验鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡或出现其它神经症状记作2，死亡鸡记3（每只死亡鸡在其死后的每日观察中仍记3）。IVPI值=每只鸡在10天内所有数字之和／(10只鸡×10天)，如指数为3.00，说明所有鸡24小时内死亡；指数为0.00，说明10天观察期内没有鸡表现临床症状。IVPI达到2.0或2.0以上者可判为新城疫中强毒感染。BFJNRUY$(037bfjnquyCGJNRVZ%(048cgjnrvzCGKOSWZ%)158cgkosvzDHLPSW#&-159dhloswAEHLPTX!&-26adhlptxAEIMQU

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